Modulación dependiente del ligando colinérgico del acoplamiento fosforilado oxidativo en células neuroblastoma BE(2)-C permeabilizadas por digitonina

El objetivo general de este experimento es demostrar un método para evaluar la bioenergética mitocondrial en células de neuroblastoma cultivadas intactas mediante combinación de permeabilización selectiva e inhibidores del sustrato. Tradicionalmente, la respiración mitocondrial se evalúa utilizando instrumentos como el respirómetro de alta resolución Oroboros O2K, el electrodo de oxígeno tipo Clark y el analizador Seahorse XF. Los métodos tradicionales que dependen de la fracción mitocondrial aislada o enriquecida de tejidos o células a menudo comprometen la estructura mitocondrial.

Por ejemplo, esta imagen de microscopio electrónico de transmisión de mitocondrias aisladas de la corteza del ratón revela un contraste claro en la integridad estructural dependiendo de si las mitocondrias están encapsuladas en terminales presinápticos o no. Las mitocondrias que permanecen encapsuladas en los terminales presinápticos parecen estructuralmente intactas, como indican las flechas cian en esta imagen. En cambio, las mitocondrias que no están encapsuladas o carecen de estructura membranosa circundante suelen aparecer deformadas, como representan las flechas amarillas.

El analizador Seahorse Flex se utiliza comúnmente para estudiar la bioenergética mitocondrial tanto en células cultivadas como en mitocondrias aisladas. En el análisis basado en células cultivadas, se preservan la arquitectura celular y las redes de señalización. Sin embargo, la membrana plasmática de las células intactas es impermeable a muchos sustratos del ciclo del ácido tricarboxílico.

Esto limita el alcance del análisis metabólico en comparación con las mitocondrias aisladas, que carecen de una barrera de membrana plasmática, pero a menudo presentan artefactos estructurales. Por tanto, ambos sistemas tienen limitaciones inherentes. La técnica presentada aquí aprovecha el hecho de que la membrana plasmática es rica en colesterol, mientras que la membrana mitocondrial contiene muy poco.

Al utilizar un detergente que liga el colesterol como la digitonina, podemos permeabilizar selectivamente la membrana plasmática dejando intacta la membrana mitocondrial. Este enfoque permite la entrada controlada de sustratos e inhibidores mitocondriales en la célula sin comprometer la integridad de los orgánulos. Así, esta técnica permite el análisis funcional de las mitocondrias en el contexto de células intactas, combinando la ventaja de la arquitectura de la célula completa con la accesibilidad de ensayos mitocondriales aislados.

Comienza el experimento con un plato de cultivo sub-confluente de tus células. Lava las células suavemente con un tampón de fosfato estéril. Añade un volumen adecuado de solución de Tritón para cubrir uniformemente la monocapa celular. Tras la incubación, retira el plato y dale golpecitos o agitaciones horizontales suavemente para ayudar a desalojar las células.

Usando una pipeta de cinco ml y un controlador de pipeta, haz la suspensión de la celda varias veces arriba y abajo para deshacer cualquier grumo y lograr una suspensión de una sola celda. Examina la suspensión de la célula bajo un microscopio para confirmar una suspensión uniforme de célula única. Cuenta las células usando un hemocitómetro o un contador celular automático.

Ajusta la concentración de la célula para que 100 microlitros de la suspensión contengan aproximadamente 10.000 celdas. Acelera cuidadosamente 100 microlitros de la suspensión de celda en cada pozo de la placa de ensayo Seahorse XF. Deja uno bien vacío para que sirva como control de fondo durante el ensayo.

Incubar la placa en una incubadora de cultivos celulares durante dos o tres horas para permitir que las células se adhieran al fondo del pozo. Una vez unidas las células, añade suavemente 300 microlitros de medio de ensayo a cada pozo. Devuelve la placa a la incubadora e incuba durante la noche para permitir que las células se estabilicen y crezcan.

Asegúrate de que las celdas formen una monocapa uniforme en el fondo de cada pozo. Evita el hacinamiento. Las células deben ser confluyentes, pero no sobreconfluentes, para garantizar un rendimiento óptimo en el ensayo.

La noche antes del experimento, hidrata el cartucho sensor XFp 24 añadiendo un ml de buffer de calibración a cada pozo. Alternativamente, puedes usar suero tampón de fosfato, pH 7,4. Deja el cartucho a temperatura ambiente durante la noche en la cama.

No es necesario incubar en una incubadora sin COT a 37 grados centígrados, ya que el cartucho se equilibrará a temperatura ambiente durante el proceso de carga. Llama a todas las soluciones congeladas y 2x microglial de prueba a temperatura ambiente. Comprueba el pH, debería ser 7,4.

Ajusta si es necesario. Prepara todo el sustrato y las soluciones de inyección y verifica el pH de nuevo. Guarda todas las soluciones en hielo hasta que se usen.

Preparar tubos de comida etiquetados como A, B, C y D para soluciones de inyección de los cartuchos de sensor. Es mejor fabricar soluciones que contengan los inhibidores o sustratos correspondientes para cada puerto. Utilizando una pipeta multicanal, carga cuidadosamente 50 microlitros de cada solución de puerto de inyección en los respectivos puertos, de la A a la D.

Inicia el bioanalizador Seahorse una o dos horas antes del experimento para permitir que la incubadora interna se estabilice a 37 grados centígrados. Etiqueta cada pozo y agrupa según tu diseño experimental y las directrices de Wave Desktop 2.6. Programa el bioanalizador para la mezcla, peso y ciclo de medición adecuados.

Consulta la tabla 8 para referencia. Es importante desactivar la opción de equilibrio al inicio del ciclo de medición. Mantenerlo encendido prolongará innecesariamente el experimento y puede agotar los sustratos.

Arranca la máquina. La máquina calibrará primero el cartucho sensor, lo que tarda aproximadamente 15 minutos. Comienza a preparar la placa de celda justo después de colocar el cartucho sensor en calibración. Aspira cuidadosamente el tampón sin alterar las células en aproximadamente 700 microlitros de 1x de tampón mitocondrial en cada pozo con células adheridas, y deja reposar la placa durante un minuto para que se equilibre.

Aspira cuidadosamente el tampón de cada pozo sin alterar las células adherentes. Repite el paso de la lavadora tres veces para asegurar un medio completo. En paralelo, añade 50 microlitros de tampón de ensayo mitocondrial a un pozo de fondo sin células.

Utiliza el menisco como referencia visual para la consistencia del volumen. Aspira cuidadosamente el tampón de los pozos que contienen la célula, dejando aproximadamente 50 microlitros para mantener la hidratación celular. Incuba la placa a 37 grados centígrados, ya sea en un baño maria, manteniéndola por encima de la superficie del agua o en una incubadora no de acero con la atmósfera saturada que evite la evaporación.

Justo antes de cargar el analizador, añade 450 microlitros de tampón mitocondrial precalentado que contenga sustratos, inhibidores o fármacos según sea necesario en cada pozo, elevando el volumen total a 500 microlitros. La placa ya está lista para ejecutar el ensayo usando el cartucho sensor calibrado en el bioanalizador Seahorse. Primero, realizamos un ensayo de acoplamiento para examinar el grado de acoplamiento entre el sistema de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa.

El ensayo de acoplamiento ayuda a distinguir la función mitocondrial de la disfunción. En este diagrama del sistema de transporte de electrones mitocondriales, mostramos los inhibidores específicos complejos uno, tres y cinco junto con los nodos de diferentes sustratos como piruvato o malato y succinato, que donan los electrones al sistema. Esta visualización es útil para entender cómo funciona el ensayo y el papel de los distintos sustratos e inhibidores.

Primero examinamos dos concentraciones diferentes de digitonina, cinco micromolares y diez micromolares, para evaluar su eficacia en facilitar el transporte de electrones a través de la membrana plasmática y permitir el ensayo de acoplamiento. En este ensayo, el nivel de acoplamiento respiratorio se evaluó midiendo secuencialmente la tasa de consumo de oxígeno en presencia de succinato como sustrato, y rotenona como inhibidor del complejo uno. Posteriormente, se inyectaron ADP, oligomicina, FCCP y antimicina A, y se registraron mediciones de OCR tras cada inyección.

El panel izquierdo muestra gráficos lineales que muestran la cinética de la tensión de ogénigeno dentro de la microcámara transitoria. Normalmente, este valor debe mantenerse entre 100 y 200 milímetros de mercurio para asegurar la detección dentro del rango dinámico del sensor. Estos conjuntos de datos se generaron utilizando el modo punto a punto en el software Agilent Wave, que muestra el OCR como una serie de tasas a lo largo del periodo de medición, permitiendo la visualización de cambios dinámicos, notablemente 10 micromolares de digitonina que aumentó el transporte de succinato en comparación con cinco micromolares, lo que resultó en una menor tensión de oxígeno en la microcámara y, en consecuencia, una mayor captación de osígeno.

La representación de los datos obtenidos de estos experimentos reveló que la respiración basal mediada por complejos dos a cuatro fue significativamente mayor con 10 micromolares de digitonina en comparación con cinco micromolares, lo que indica un transporte succinado más eficiente a través de la membrana plasmática permeabilizada a concentraciones más altas. Basándonos en esta observación, y dado que 10 micromolares de digitonina proporcionaban una permeabilización óptima, posteriormente redujimos el número de células a 20.000 células por pozo para reducir la respiración basal. Este ajuste aseguró que cualquier mejora respiratoria inducida por fármacos o sustratos permaneciera dentro del rango dinámico de detección del sistema.

Una vez optimizada la concentración de digitonina y el número de células, se realizó el siguiente ensayo de acoplamiento para evaluar los efectos de los agonistas muscarínicos y antagonistas sobre la respiración mitocondrial. Un hallazgo importante de este conjunto de experimentos fue que en células digitoninas no tratadas, la respiración basal mediada por complejos impulsados por succinatos dos a cuatro, así como la respiración en estado 3 y estado 3u, se redujo significativamente. Esto indica que el succinato no fue transportado al interior de la célula en condiciones no permeables.

La trazada de los datos de múltiples experimentos independientes reveló que el antagonista muscarínico atropina redujo significativamente la respiración basal mediada por complejos dos a cuatro en células neuroblastomas en comparación con el agonista muscarínico acetilcolina, que mantuvo un alto nivel de respiración. Además, tanto la respiración en estado 3 como en estado 3u fueron significativamente menores en células no permeabilizadas que en células permeabilizadas, lo que subraya la eficacia de la digitonina para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática sin afectar la función mitocondrial. El ensayo de flujo de electrones evalúa la transferencia secuencial de electrones a la cadena de transporte mitocondrial, ayudando a identificar los mecanismos de disfunción o modulación mitocondrial.

En la fase inicial del ensayo, las células fueron tratadas con piruvato, malato y FCCP, lo que indujo un alto nivel de respiración no acoplada impulsada por complejos uno a cuatro. La posterior adición de rotenona inhibía el complejo uno, reduciendo la respiración basal y aislando la actividad del complejo dos a cuatro. Aunque no observamos diferencias significativas entre las condiciones tratadas con fármacos y las de control, una observación importante fue que la respiración en estado 3u impulsada por succinatos fue significativamente menor en células no permeabilizadas, lo que indica el papel crítico de la digitonina en la entrada de succinatos en la célula.

En resumen, este protocolo ofrece una forma fiable de estudiar la bioenergética mitocondrial. Combina la relevancia fisiológica de la arquitectura celular completa con la precisión de ensayos mitocondriales aislados, permitiendo la administración controlada de sustratos e inhibidores mientras preserva la integridad de los orgánulos. Optimizando la concentración de digitonina y la densidad celular, los investigadores pueden lograr mediciones precisas y reproducibles.

Este enfoque adaptable es ideal para explorar la modulación mediada por receptores de la función mitocondrial y proporciona una plataforma poderosa para la investigación de enfermedades y el descubrimiento de fármacos.