Perfilado de accesibilidad de la cromatina en larvas completas de Caenorhabditis elegans L4

Nuestra investigación se centra en cómo la regulación epigenética moldea la expresión génica, específicamente cómo la accesibilidad de la cromatina controla la actividad génica en diferentes condiciones biológicas. ATAC-seq en C.elegans está limitado por su cutícula protectora. Nuestros protocolos superan esta barrera para permitir un análisis confiable de la accesibilidad de la cromatina.

Para comenzar, obtenga una población sincrónica de gusanos L1 y permítales crecer durante 26 horas a 20 grados Celsius. Confirme bajo el microscopio que la mayoría de los gusanos están en la etapa L4. Recupere todos los gusanos de las placas con tampón M9 y transfiéralos a un tubo de centrífuga de 1.5 mililitros.

Lave los gusanos cinco veces con un mililitro de agua estéril dejando que se asienten por gravedad. Luego, transfiera el tubo que contiene los gusanos a un incubador de 25 grados Celsius durante 30 minutos para eliminar los restos de comida intestinal. Luego tome 50 microlitros del pellet de gusanos y colóquelo en un nuevo tubo.

Para lisar los gusanos, agregue 200 microlitros de tampón SDS-DTT fresco y mezcle en un rotador de tubos durante exactamente cinco minutos. Luego, agregue un mililitro de tampón de huevo frío. Luego centrifugue en un picofuge para eliminar el sobrenadante y repita seis veces.

Después de eso, agregue 80 microlitros de pronasa recién preparada. Usando una pipeta de 200 microlitros con puntas filtradas, mezcle la mezcla de gusanos y pronasa 70 veces e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Agregue 800 microlitros de medio L15 con suero bovino fetal al 10% y centrifugue a 500G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Después de retirar el sobrenadante, agregue un mililitro de medio L15 con suero bovino fetal al 10% y centrifugue como se demostró anteriormente. Una vez que el pellet se haya lavado tres veces, retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 900 microlitros de medio L15 con suero bovino fetal al 10%. Luego filtre la suspensión usando un filtro de 20 micrómetros.

Centrifuge la suspensión celular filtrada a 500G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Luego retire el sobrenadante, dejando aproximadamente 50 microlitros. Agregue 45 microlitros de tampón de lisis recién preparado y resuspenda cuidadosamente la muestra.

Luego agregue cuidadosamente 50 microlitros de tampón de lavado sin mezclar la muestra. Centrifugue a 500G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante y mantenga la muestra en hielo.

Mientras centrifuga, prepare la mezcla de TN5 por muestra combinando 25 microlitros de tampón TN5, 24.8 microlitros de agua libre de nucleasas y 0.2 microlitros de enzima TN5. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y mantenga los núcleos en hielo. Agregue 50 microlitros de mezcla TN5 al pellet nuclear.

Luego pipetee hacia arriba y hacia abajo siete veces para mezclar. Incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos en un bloque térmico y golpee suavemente el tubo cada 10 minutos. Después de la incubación con TN5, agregue 300 microlitros de tampón PB y mezcle agitando a máxima velocidad durante 25 segundos.

Transfiera todo el volumen del tubo a la columna de giro. Centrifugue a temperatura ambiente durante un minuto a máxima velocidad. Agregue 750 microlitros de tampón PE a la columna de giro y centrifugue nuevamente.

Luego descarte el sobrenadante con el tubo de recolección. Después de un giro vacío, coloque la columna en un nuevo tubo etiquetado de 1.5 mililitros. Agregue 10 microlitros de tampón EB a 37 grados Celsius en el centro de la columna sin tocarlo.

Déjelo a temperatura ambiente durante un minuto. Luego centrifugue durante un minuto a máxima velocidad a temperatura ambiente. Luego repita los pasos de elución para obtener un volumen final de 20 microlitros en tampón EB.

Realice una PCR en tiempo real para estimar el número adecuado de ciclos de amplificación para la amplificación de la biblioteca ATAC. Estime el número final de ciclos de amplificación seleccionando el ciclo en el que la señal de amplificación alcanza 1/3 de su máximo para cada muestra. Realice la amplificación final para la biblioteca ATAC y asigne un cebador reverso diferente a cada muestra y regístrelo.

Amplifique cada muestra durante el número de ciclos estimado para esa muestra. Realice la reacción en cadena de la polimerasa presentada en tubos de 200 microlitros usando 10 microlitros de biblioteca de ADN en un volumen de reacción total de 50 microlitros. Guarde las muestras a menos 20 grados Celsius si pausa el protocolo.

Después de purificar la biblioteca amplificada, realice electroforesis capilar para ver el patrón de distribución del tamaño del fragmento. La curva de amplificación que resulta en una amplificación final estimada de la biblioteca de menos de 15 ciclos indica un material de buena calidad adecuado para continuar. La curva de amplificación que muestra un aumento retrasado indica un material de mala calidad y no debe continuarse.

La distribución de longitud de fragmentos después de la amplificación mostró patrones nucleosómicos de aproximadamente 150 pares de bases y 300 pares de bases en muestras válidas. Un patrón de fragmentos borroso indicó ADN demasiado fragmentado que requiere repetir la muestra. Nuestro protocolo permitirá el perfilado de accesibilidad de la cromatina en todo el genoma en gusanos enteros para comprender cómo los entornos influyen en la regulación génica.

El desafío clave es equilibrar la entrada de gusanos y la actividad de TN5 para evitar una tagmentación insuficiente o excesiva, asegurando un perfilado óptimo de la accesibilidad de la cromatina. Este enfoque abre oportunidades para estudiar la variación epigenética a través de aislamientos salvajes, condiciones ambientales e incluso especies alternativas.