Microdisección por captura láser de tejido hepático de ratón fijado con paraformaldehído para análisis de ARN

Nuestra investigación investiga principalmente la fisiopatología relacionada con hepatocitos en el contexto de enfermedades hepáticas crónicas. Este protocolo permite el aislamiento celular en cortes de tejido hepático y la extracción de ARN. A diferencia del protocolo FFPE, o protocolo paraformaldehído fijado o CT preservado e iterado, lo que permite una micro discusión precisa y muestras de alta calidad para análisis OMI posteriores.

Para empezar, expone las láminas de la membrana del bolígrafo a la luz ultravioleta en cuatro minutos y 30 minutos. Cubre las láminas con 0,1 miligramos por mililitro de polilisina y déjalas secar al aire. Sella los bordes de cada corredera con un medio de montaje neutro.

Utilizando un agente de descontaminación por RNasa, limpia todas las superficies accesibles del criostato y todas las herramientas. Usando etanol al 75%. Limpia bien el cepillo y las herramientas.

Ahora, ajusta la temperatura del criostato a menos 20 grados Celsius y deja que se estabilice. Recupera las muestras de hígado de almacenamiento a menos 80 grados Celsius. Coloque las muestras en la cámara del criostato durante al menos 15 minutos para que se equilibren.

Aplica una capa de compuesto OCT de dos a tres milímetros de grosor sobre la etapa de la muestra. Luego coloca la etapa de muestra en una repisa libre rápida o dentro de la cámara del criostato para presolidificar la capa compuesta. Después de aplicar una pequeña cantidad de compuesto OCT sobre la capa presolidificada, coloca el bloque de tejido equilibrado horizontalmente sobre el compuesto y mantenlo en su lugar durante 10 a 15 segundos.

Luego monta la etapa de la muestra con el bloque de tejido adjunto sobre la cabeza del criostato. Ahora inserta la hoja con cuidado entre las placas de sujeción y las placas traseras desde un lado del criostato. Sujeta la palanca de sujeción para asegurar la hoja.

Ajusta el grosor del criostato a 10 micrómetros. Corta el tejido en secciones y móntalas directamente sobre las láminas de membrana pretratadas dentro de la cámara del crióstato, mantenidas a menos 20 grados Celsius. Descongela los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Lava las láminas tres veces con PBS libre de ACE RN cuatro veces cada 10 segundos cada lavado. Añade la solución filtrada de hematoxilina de Mayer sobre las secciones de tejido durante cinco a diez segundos. Luego lava las láminas tres veces con agua libre de ribonucleasa durante 10 segundos en cada lavado para eliminar la hematoxilina residual.

Evalúa la calidad de la tinción bajo un microscopio. Con papel absorbente, seca las láminas y déjalas secar completamente al aire. Limpia la superficie del banco de laboratorio con agente de descontaminación RNasa.

Enciende el controlador y deja que el microscopio complete la inicialización. Gira la tecla en sentido horario desde la posición apagada hasta la encendida para iniciar el sistema láser. Enciende el ordenador y lanza el software de microdisección de captura láser.

Luego espera a que se complete la inicialización. Ahora inserta un tubo PCR estéril de 0,2 mililitros en el dispositivo de recogida. Usando una pipeta, añade 10 microlitros de buffer de digestión de proteasa K a la tapa del tubo de PCR.

Carga el dispositivo de recogida en el soporte para muestras del microscopio. En la ventana del dispositivo de cambio de recolectores. Ve a ajustar el punto de referencia, ajusta el enfoque de la cámara para ver claramente el punto de referencia y usa los controles de flecha para centrarlo si es necesario.

Carga una sección de tejido en el soporte de la muestra con el tejido orientado hacia abajo y la posición de la etiqueta a la derecha. Selecciona la lente objetivo 10 x e identifica regiones de interés con características patológicas específicas. Navega al menú láser.

Haz clic en calibrar, selecciona sí y completa la calibración. En el panel de control láser, ajusta la potencia láser a 50, apertura a cinco y velocidad a nueve. Luego usa la barra de herramientas gráfica para dibujar un círculo alrededor del área objetivo.

Selecciona una sola forma, pulsa start cut para realizar microdisección de captura láser y posiciona el dispositivo de recogida para recoger el tejido disecado. Para capturar documentación e imágenes, selecciona archivo y selecciona guardar imágenes para guardar imágenes antes y después en el formato preferido. Después de recoger las celdas deseadas, haz clic en descargar para retirar el colector de la etapa.

Verifica que queden 10 microlitros de buffer de digestión de proteasa K en la tapa y repón si es necesario. Cierra el tubo y haz un vórtice bien en el vórtice. Luego gira el tubo brevemente en una centrífuga.

Guarda el tubo a menos 80 grados Celsius hasta la extracción de ARN. La sección hepática teñida con hematoxilina en la lámina del lápito se visualizó al microscopio antes y después de la microdisección por captura láser. Las regiones de interés que presentaban esteatosis microvesicular se recogieron con precisión en la tapa del tubo A de PCR.

Preservando la morfología celular intacta. El ácido ribonucleico total extraído de aproximadamente 1000 y 2000 células aisladas de microdissección por captura láser produjo 110,7 nanogramos y 213,3 nanogramos respectivamente. Todas las muestras mostraron alta pureza con proporciones de absorción de 260 por 280 nanómetros entre 1,9 y 2,1.

La electroforesis en gel reveló bandas de ácido ribosómico 28 s y 18 s de ribosómica nucleica. Perfiles de bioanalizadores de ácido ribonucleico desde tan solo 1000 células. Me dio un índice de integridad de ácido ribonucleico de 6,7.

Q-R-T-P-C-R para el gen de mantenimiento Beta actina dio valores umbral del ciclo que oscilaban entre 17 y 19. La evaluación por bioanalizador de bibliotecas de secuenciación construidas a partir de 50 nanogramos de ácido ribonucleico total mostró un pico característico entre 300 y 500 pares de bases. La secuenciación de ARN de estas bibliotecas produjo datos de alta calidad con puntuaciones tanto en el Q 20 como en el Q 30, superando el 90% y con una tasa de error baja entre réplicas.

Una consideración importante es prevenir la antidegradación mediante el cese de control, la tinción rápida y las condiciones rectas durante nuestro procesamiento. Ordenar este procedimiento puede usarse para PCR en tiempo real y secuenciación con claves de biblioteca optimizadas para fragmentación. Establecido en muestras de hígado.

Este protocolo permite el perfilado de subgrupos de hepatocitos y apoya la investigación hepatológica centrada en la patología.