Un protocolo para la extracción de suspensión de célula única de córneas de ratón
3 de abril de 2026
Aquí presentamos un protocolo para obtener suspensiones unicelulares de alta calidad de córneas completas de ratón mediante digestión secuencial con colagénasa A y tripsina. Este método produce células individuales viables con alta integridad de ARN, haciéndolas compatibles con aplicaciones posteriores como la secuenciación de ARN unicelular y el citometradory de flujo.
Este protocolo introduce principalmente un método para obtener células individuales de alta calidad a partir de córneas intactas de ratón. Nuestro método es una célula única viable con alta integridad de ARN, lo que las hace compatibles con aplicaciones posteriores como célula única en un espacio grueso y delgado y con diámetro de flujo. Para empezar, coloca una ratona C57BL6 hembra eutanasiada de seis a ocho semanas sobre una mesa de disección estéril.
Después de enjuagar los párpados cerrados con PBS, utiliza tijeras oftálmicas para hacer una incisión a lo largo del polo posterior del globo ocular y coloca cuidadosamente el ojo aislado en una placa de Petri que contiene medio epitelial hormonal suplementario helado. Después de enjuagar el globo ocular tres veces con 1XPBS suplementado con estreptomicina al 5% de penicilina, se utilizan tijeras oftálmicas y pinzas para hacer una incisión desde el polo posterior hacia el limbo corneal. Desprende suavemente la córnea de la esclerótica y la conjuntiva a lo largo del borde limbal y, con dos pares de pinzas, elimina completamente el cristalino y el iris.
Después de lavar el tejido corneal tres veces en PBS, transfiere el tejido limpio a un tubo nuevo. Añade un mililitro de cinco miligramos por solución de colagenasa A y tritura el tejido en fragmentos de aproximadamente 0,5 por 0,5 milímetros usando tijeras oftálmicas. Incubar el tubo que contiene los fragmentos corneales con solución de colagenasa A en una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius durante una hora.
Inspecciona el tejido cada 10 minutos durante la digestión. Cuando no quedan fragmentos grandes de tejido, centrifugar la muestra a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y luego aspirar cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, resuspende el pellet en 200 microlitros de solución EDTA al 0,25% de tripsina.
Coloque el tubo en una incubadora de cultivo celular ajustado a 37 grados Celsius durante 10 minutos para digerir los fragmentos de tejido restantes. Finalmente, utiliza una pipeta P1000 equipada con una punta de ánima ancha para triturar suavemente la mezcla y obtener una suspensión de celda única. Centrifugar la suspensión de la celda como se ha demostrado anteriormente y volver a suspender el pellet en PBS que contenga 0,04% de BSA.
Al contar las células corneales aisladas con un hemocitómetro, se encontró que se obtuvo un total de 1,05 por 10 a la potencia de cinco células de ocho córneas con una viabilidad celular media del 94,6% y una proporción de células individuales superior al 96,3%, confirmando la idoneidad de la suspensión para aplicaciones posteriores. El análisis de inmunofluorescencia mostró que la suspensión celular estaba compuesta por un 83,5% de células epiteliales pan-CK positivas, un 13,5% de células estromales positivas para queratocanos y aproximadamente un 3% de células negativas para ambos marcadores. El ARN extraído de la suspensión unicelular mostró un alto índice de integridad del ARN de alrededor de 8,8 y una proporción de ARN ribosómico de 28S por 18S de aproximadamente 2,15, lo que confirma una excelente calidad del ARN.
Tras obtener células individuales, podemos caracterizar la función celular corneal y la exploración de marcas superficiales. Esta zona se dedica al estudio de las interacciones célula a célula. Un reto en este método es separar prácticamente la córnea de otros tejidos.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo robusto para aislar suspensiones de células individuales de alta calidad a partir de córneas completas de ratón. El método combina una disección tisular precisa con una digestión enzimática secuencial, lo que permite la preparación de células individuales viables adecuadas para aplicaciones posteriores, como la secuenciencia de ARN a nivel de célula individual (scRNA-seq) y la citometría de flujo. El protocolo proporciona un alto número de células, una excelente viabilidad y preserva la integridad del ARN, facilitando un análisis detallado de la heterogeneidad celular corneal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Oftalmología
- Biología celular
- Análisis de célula individual
Antecedentes
- La córnea es la capa más externa del ojo, esencial para la visión y la homeostasis de la superficie ocular.
- La secuenciación de ARN a nivel de una sola célula (scRNA-seq) requiere suspensiones de células individuales de alta calidad.
- El tejido corneal es denso y complejo, lo que dificulta la disociación celular.
- Los protocolos existentes a menudo producen baja viabilidad celular o mala calidad del ARN.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo confiable para generar suspensiones de células individuales a partir de córneas de ratón intactas.
- Asegurar una alta viabilidad celular y la integridad del ARN para aplicaciones posteriores.
- Permitir la identificación y cuantificación precisas de los principales tipos celulares corneales.
Métodos Utilizados
- Diseción de córneas de ratones C57BL6 sacrificados.
- Digestión enzimática secuencial utilizando colagenasa A y tripsina-EDTA.
- Minución mecánica y trituracion suave para obtener una suspensión de células individuales.
- Evaluación de la viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano y recuento con hemocitómetro.
- Tinción por inmunofluorescencia para Pancytokeratin (células epiteliales) y Keratocan (células estromales).
- Análisis de la integridad del ARN utilizando un bioanalizador.
Resultados principales
- Se obtuvieron aproximadamente 1,05 × 105 células de ocho córneas.
- Alta viabilidad celular (94,6 %) y proporción de células individuales (96,3 %).
- Composición celular: 83,5 % de células epiteliales positivas para pan-CK, 13,5 % de células estromales positivas para queratocan, ~3 % negativas para ambos marcadores.
- Número de integridad del ARN (RIN) de ~8,8 y relación de ARNr 28S/18S de ~2,15, lo que indica una excelente calidad del ARN.
Conclusiones
- El protocolo produce de manera confiable suspensiones de células individuales de alta calidad a partir de córneas de ratón.
- Las preparaciones celulares son adecuadas para aplicaciones posteriores exigentes, incluida la secuenciación de ARN a nivel de una sola célula (scRNA-seq).
- Este método facilita estudios detallados de la función celular corneal y de las interacciones entre células.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las suspensiones de células individuales de alta calidad obtenidas de córneas de ratón son esenciales para impulsar la investigación oftálmica en fase de descubrimiento y permitir el perfilado celular de alta resolución. Este protocolo aborda un cuello de botella crítico en la preparación de células individuales viables y con ARN intacto a partir de tejido ocular denso, lo que afecta directamente la fiabilidad de los análisis posteriores a nivel de célula individual. Una preparación celular robusta mejora la confianza predictiva en la validación de dianas y apoya la continuidad traslacional entre las fases de descubrimiento y preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofarmacéuticos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación de la heterogeneidad celular corneal a resolución de célula individual.
- Apoya la validación funcional de dianas al preservar la viabilidad celular y la integridad del ARN.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la identificación precisa de tipos celulares.
- Mejora la confianza predictiva en la selección temprana de dianas oftálmicas.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Proporciona suspensiones de células individuales estandarizadas y con alta viabilidad para el desarrollo de ensayos.
- Asegura la reproducibilidad y la obtención cuantitativa de resultados en secuenciación de ARN a nivel de célula única.
- Prepara material biológico validado para flujos de trabajo de cribado escalable.
- Permite la evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre poblaciones celulares corneales distintas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad al preservar la diversidad nativa de las células corneales.
- Mantiene la calidad del ARN para el descubrimiento y la validación de biomarcadores traslacionales.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al garantizar la continuidad de los datos desde la fase de descubrimiento hasta las etapas preclínicas.
- Reduce la ambigüedad biológica en estudios preclínicos oftálmicos.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
Este protocolo se integra en la interfaz entre el descubrimiento temprano y la investigación preclínica, permitiendo una transición fluida desde la disociación del tejido hasta el análisis a nivel de célula individual y estudios funcionales posteriores.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir un perfilado de célula individual de alta fidelidad.
- Tamizaje: Proporciona suspensiones cuantitativas y reproducibles de células individuales listas para ensayos y tamizaje de compuestos.
- Análisis: Ofrece métricas robustas de viabilidad celular, cuantificación de tipos celulares e integridad del ARN para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conserva la diversidad celular y la calidad del ARN para la alineación de biomarcadores y validación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado adaptable a través de programas de investigación oftálmica.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Proporciona preparaciones estandarizadas, reproducibles y escalables a nivel de célula individual.
- Valor estratégico: Permite decisiones informadas de avance/no avance y mejora la eficiencia del capital en I+D oftálmica.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos en fase de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de tejidos oculares y en técnicas de digestión enzimática.
- Necesita acceso a ensayos de viabilidad celular, inmunofluorescencia y equipos para el análisis de la integridad del ARN.
- Exige estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Adaptable a otros tipos de tejidos densos mediante la optimización del protocolo.
- La precisión en la separación del tejido es fundamental para evitar contaminación y asegurar la pureza de la muestra.
