Prueba de neutralización de reducción de fluorescencia del virus de la hepatitis E para medir títulos neutralizantes de anticuerpos

El principal objetivo de la prueba de neutralización basada en reducción de fluorescencia es cuantificar el potencial de neutralización de un candidato a vacuna y de los anticuerpos contra el HEV. La conocida naturaleza citopática del HEV limita el ensayo PRND. Este protocolo se centra en el entrenamiento inmunológico PRND para visualizar las células infectadas y, posteriormente, minar. Para empezar, contar las células HuH-7 recién divididas.

Luego, colocar una capa de vidrio de grado microscopico en una placa de 12 pozos y sembrar 0,2 millones de celdas por pozo en un DMEM completo de un mililitro suplementado con un 10% de FBS. Incuba las células durante la noche a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, añade 500 microlitros de medios sin suero que contengan 1,8 veces 10 a la potencia de cuatro copias genómicas de g1-HEV purificado a las células sembradas.

Incuba a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante una hora. Usa 500 microlitros de DPBS para lavar las células tres veces. Añade dos mililitros de DMEM complementados con un 2% de FBS a los pozos.

Incuba las células a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. Lava las células tres veces con 500 microlitros de DPBS, incubando durante cinco minutos a temperatura ambiente entre cada lavado. Añade 500 microlitros de 4% de paraformaldehído a las células e incubalas a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Luego, lava las células con DPBS como se ha demostrado antes. Después del lavado final, incubalos en DPBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Añade 250 microlitros de solución bloqueante que contiene un 5% de suero normal de cabra, 0,5% de albúmina sérica bovina y 0,3% de Triton X100 en DPBS.

Incuba en un shaker durante una hora a temperatura ambiente. Retira la solución bloqueante y lávate una vez con 500 microlitros de DPBS. Luego añade 250 microlitros de solución primaria de anticuerpos con una dilución de uno a 500.

Incuba las células durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, lava las células con DPBS tres veces, como se ha demostrado antes. Añade 100 microlitros de anticuerpo secundario con una dilución de uno a 1.000 y incuba durante una hora a temperatura ambiente en una cámara humificada.

Realiza el ciclo de lavado e incubación como se ha demostrado antes. Añade 10 microlitros de reactivo antifade con DAPI en una lámina de vidrio. Monta la cubierta con las celdas orientadas hacia el reactivo evitando burbujas de aire.

Sella el engobe de la cubierta con esmalte de uñas para conservarlo y poder visualizar la microscopía confocal. Cuenta las células HuH-7 recién divididas. Luego, colocar una cubierta de vidrio de grado microscópico en una placa de 12 pozos y sembrar 0,2 millones de celdas en un DMEM completo de un mililitro por pozo.

Al día siguiente, preparar una dilución en serie diez veces mayor de anticuerpos anti-ORF2 e inmunoglobulina G de conejo en medios libres de suero, con una concentración inicial de 25 microgramos por mililitro, y hasta una dilución final de 10 a menos cinco. El volumen final de la dilución debe ser de 100 microlitros. Luego, añadir 1,8 por 10 a la potencia de cuatro copias genómicas de g1-HEV purificado a cada dilución de anticuerpos.

Incubar la mezcla de anticuerpos a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante una hora. Lava las células con 500 microlitros de DPBS. Añade la mezcla de antivirus de anticuerpos a las células.

Incuba a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante una hora. Lava las células con un tampón de 500 microlitros. Después de añadir DMEM con 2% de FBS, incuba durante 72 horas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.

Procesar las células para la tinción inmunofluorescente, como se demostró anteriormente. Después de adquirir las imágenes de fluorescencia, abre el software ImageJ. Selecciona Archivo y abre la imagen.

Luego, selecciona Imagen, Tipo y haz clic en 8 bits para convertir la imagen RGB a formato de 8 bits. Ajusta el umbral seleccionando Imagen y ajustar, luego Umbral, poniendo el nivel inferior en 40 y el nivel superior en 255. Selecciona Analizar, elige Analizar partículas y activa Mostrar resultados, Borrar resultados, Resumir, Excluir en aristas y Regiones compuestas de interés.

Luego haz clic en OK para obtener el número de puntos fluorescentes. Calcula el porcentaje de neutralización y NT50 como el antilog de Log10 NT50, usando la fórmula proporcionada. Grafica el gráfico que muestra la media y la desviación estándar de todos los campos.

Se detectó un nivel significativo de ácido ribonucleico g1-HEV en células infectadas en comparación con células infectadas simuladamente. El ensayo de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-ORF2 confirmó la expresión de ORF2 en las células HuH-7 infectadas. El título de neutralización del 50% del anticuerpo anti-ORF2 se estimó en 2,1 por 10 a la potencia de tres.

Imágenes representativas muestran la aparición de células HuH-7 infectadas simuladamente y con g1-HEV en la prueba de neutralización de reducción de fluorescencia. Este protocolo permite a los investigadores estudiar el potencial de neutralización de los anticuerpos anti-HEV y medir su título de neutralización del 50%. El paso crítico de este protocolo es el aislamiento del virus infeccioso de la hepatitis E y la correcta tinción celular y adquisición de imágenes de alta resolución.

Métodos alternativos como RT-qPCR y ELISA pueden utilizarse para determinar el título de neutralización, aunque presentan algunas limitaciones.