Name: Electrofisiología de un solo canal utilizando un sistema miniaturizado de bicapa lipídica planar Montal-Mueller para registrar un canal K2P sintético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-10-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprende electrofisiología de un solo canal con el sistema miniaturizado BLMchipMM para registrar el canal K₂P ancTREK1. Esta plataforma reduce el consumo de reactivos y simplifica el análisis funcional de canales iónicos.

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Agradecemos a Sofia Diletta Guzzeloni por su ayuda con el procedimiento de transfección celular. Estamos agradecidos con los empleados de Elements, la Dra. Leon Juarez y el Dr. Michelangelo Paci. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Medicina Molecular de la Universidad de Pavía, Italia, en el marco de la iniciativa Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027), por la Fundación Cariplo (#2019-1809) y por el Programa de Investigación PNRR CN00000013 «Centro Nacional para HPC, Big Data y Computación Cuántica» concedido a M.L.

F.T. y A.P. son el director ejecutivo y un empleado de Elements S.r.l., respectivamente. Todos los demás autores declaran no tener intereses en conflicto.

En este estudio, utilizamos la técnica PLB para evaluar las propiedades electrofisiológicas de un canal K2P sintético a nivel de molécula individual. Entre los diversos modelos de lípidos planares descritos en la literatura científica, nos centramos en la formación de membranas lipídicas bimoleculares (BLMs), que se pintan sobre una abertura con un diámetro entre 50 y 140 µm, perforada en una superficie vertical no polar que separa dos compartimentos acuosos. Esta configuración permite simular el entorno de la membrana celular manteniendo el control sobre los parámetros experimentales, incluyendo la preparación de la membrana lipídica y la composición del electrolito (por ejemplo, fuerza iónica y pH)3. Reconstruimos las BLMs utilizando el método de Montal–Mueller (por plegamiento)5, en el cual la membrana se ensambla espontáneamente cuando dos monocapas lipídicas, previamente extendidas en la interfaz aire–agua de las dos soluciones acuosas, se unen sobre la abertura al elevar el nivel del agua.
El protocolo presentado aquí para la formación de membranas es muy intuitivo; sin embargo, varios pasos críticos influyen fuertemente en el éxito experimental. Para garantizar una conexión eléctrica adecuada entre el BLMchipMM y el amplificador, es esencial evitar la cloración de los extremos de los hilos de Ag/AgCl que se insertan en los conectores de la PCB. Durante el ensamblaje del BLMchipMM, una colocación inadecuada de los hilos puede provocar contacto con la carcasa del amplificador, lo que lleva a cortocircuitos y saturación de la señal. El procedimiento de pretratamiento del orificio es otro factor crítico: aplicar demasiada fuerza durante la aplicación de la solución de pretratamiento puede dañar el septo de poliimida, mientras que un manejo inadecuado de la solución electrolítica—especialmente remojar la región del orificio—puede afectar negativamente la formación de la membrana. Además, una limpieza cuidadosa de la cámara de registro del BLMchipMM es esencial para la reproducibilidad. El uso de alcohol isopropílico al 100 %, seguido de un enjuague exhaustivo y un secado completo, asegura que los residuos no interfieran con experimentos posteriores.
Es posible realizar varias modificaciones al protocolo. Aunque la cloración mediante remojo en lejía representa un enfoque práctico y ampliamente utilizado, también pueden emplearse métodos alternativos como la electrodeposición43. De manera similar, son factibles variaciones en el pretratamiento y en la preparación de lípidos. Las soluciones estándar de pretratamiento suelen consistir en alcanos de cadena larga disueltos en disolventes hidrocarburos volátiles36; aunque comúnmente se utiliza una solución al 1 % de hexadecano en n-hexano, otros disolventes pueden ser adecuados. La composición lipídica también puede adaptarse según los requisitos experimentales. Aunque los lípidos DPhPC proporcionan una estabilidad óptima de la membrana, pueden usarse mezclas lipídicas alternativas, incluyendo composiciones naturales o sintéticas36. Una ventaja clave de las bicapas lipídicas verticales formadas mediante el método de plegamiento es la capacidad de generar membranas asimétricas, en las que cada hojuela consiste en especies lipídicas diferentes5,22, una característica que se sabe influye en la función de las proteínas de membrana.
La solución de problemas en la formación de la membrana generalmente implica ajustes en los niveles de la fase acuosa. Si inicialmente no se produce la formación de la membrana, bajar y subir repetidamente el nivel del tampón en un compartimento puede facilitar el ensamblaje de la bicapa. Si este procedimiento no tiene éxito, aplicar una burbuja de aire sobre la apertura puede promover la redistribución de lípidos y la formación de la membrana. El fracaso persistente generalmente indica problemas relacionados con el pretratamiento o la contaminación, en cuyo caso se recomienda limpiar la cámara de registro y reiniciar el experimento.
Los componentes principales de este sistema incluyen el amplificador compacto eNPR de 100 kHz y el BLMchipMM. El amplificador es un sistema compacto de bloqueo de voltaje de bajo ruido que elimina la necesidad de dispositivos externos adicionales, incluyendo jaulas de Faraday externas, ya que la carcasa del amplificador proporciona un apantallamiento electromagnético eficaz. El BLMchipMM es una cámara de registro miniaturizada y preensamblada, integrada con una placa de circuito impreso (PCB) para conexión directa al amplificador. Consiste en dos compartimentos con forma de C separados por un septo de poliimida con una abertura cónica perforada con láser, donde se forma la membrana artificial. Las dimensiones reducidas del sistema, con volúmenes de compartimento de aproximadamente 110 µL, disminuyen significativamente el consumo de reactivos y reducen la capacitancia intrínseca, mejorando así la calidad de la señal. Además, el dispositivo puede reutilizarse varias veces sin necesidad de desmontarlo, siempre que se sigan los procedimientos adecuados de limpieza, lo que reduce la variabilidad y mejora la reproducibilidad experimental.
A pesar de estas ventajas, deben considerarse algunas limitaciones. La configuración actual no incluye módulos integrados para el control de temperatura, presión o perfusión. Se ha informado que la tensión intrínseca de la membrana influye en los canales mecanosensibles como TREK144,45,46; sin embargo, la configuración actual no incluye la manipulación controlada de la tensión de la membrana, y aquí no se extraen conclusiones mecanicistas. En general, esta plataforma proporciona un sistema robusto y accesible para registrar la actividad de canales iónicos en membranas artificiales. En este estudio, investigamos el canal sintético K2P ancTREK1, un canal ancestral derivado computacionalmente de la subfamilia TREK. Los datos registrados demuestran que ancTREK1 purificado, reconstituido en PLBs, exhibe un comportamiento de canal individual consistente con las propiedades de conductancia reportadas para canales tipo TREK1. En condiciones simétricas de potasio 200 mM sin Mg2+, el canal muestra una relación I–V medible, con valores de amplitud de aproximadamente 13 pA a 80 mV y −19 pA a −80 mV. Además, ancTREK1 exhibe el modo característico de alta conductancia observado en los canales TREK1, con mayor conductancia a potenciales negativos (~205,6 pS) en comparación con potenciales positivos (~112,8 pS). Destacablemente, ancTREK1 muestra un NPo aumentado a potenciales positivos (0,78 a 80 mV) y un NPo reducido a potenciales negativos (0,53 a −80 mV y 0,28 a −120 mV), lo cual difiere de las observaciones en configuraciones de parche exciso42. Estos hallazgos respaldan el uso de este sistema para la grabación de prueba de principio de proteínas de membrana reconstituidas a nivel de canal individual.

La reconstrucción de canales iónicos en membranas bimoleculares lipídicas artificiales, también conocidas como membranas lipídicas negras (BLM), es una de las técnicas establecidas para realizar la caracterización electrofisiológica de canales iónicos a nivel de molécula individual1. Las ventajas de las BLM provienen de su estructura. De hecho, se crea un bimolécula lipídica planar (PLB) dentro de un poro en una superficie no polar, separando dos soluciones líquidas. Así, al imitar una membrana biológica, permite registrar la actividad de los canales iónicos en condiciones altamente controladas, incluyendo la composición lipídica de la membrana y las concentraciones de electrolitos o compuestos químicos, mientras permanece accesible desde ambos lados. Esta accesibilidad también permite insertar directamente los canales iónicos, por ejemplo, desde una solución micelar o mediante fusión inducida por liposomas2,3.
El primer sistema de membrana artificial descrito fue creado mediante la técnica de pintado4, en la que una gota de lípidos disueltos en un disolvente orgánico no volátil se aplica sobre una pequeña abertura con un pincel. La adición de una solución acuosa a ambos lados de la abertura conduce entonces a la formación espontánea de una bicapa lipídica. Sin embargo, una desventaja importante de este método es la retención de trazas de disolvente, lo que puede afectar las propiedades de la membrana. Para reducir la cantidad de disolvente orgánico residual en las bicapas lipídicas, se desarrolló el método de plegado5, que permite la formación de membranas lipídicas bimoleculares (BLM) «libres de disolvente». En este enfoque, una solución lipídica en un disolvente volátil se extiende sobre la superficie del agua para formar dos monocapas, y al elevar gradualmente el nivel de la fase acuosa por encima de la abertura, estas monocapas lipídicas se pliegan sobre la abertura para formar una bicapa. No obstante, aunque la BLM resultante se define como libre de disolvente, la formación exitosa de la bicapa requiere un pretratamiento de la abertura con una fina capa de disolvente no volátil. El elemento fundamental necesario para estos experimentos consiste en una cámara de registro con dos compartimentos acuosos (denominados típicamente cis y trans) separados por un septo lipofílico con una pequeña abertura (de 50 a 250 µm de diámetro) (Figura 1). Se insertan electrodos de cloruro de plata/plata (Ag/AgCl) en cada compartimento. Al sumergirse en la solución electrolítica, estos electrodos establecen la conexión electroquímica entre la bicapa lipídica y el equipo de registro. Este último consiste en un amplificador de bloqueo de voltaje, que permite un control preciso del potencial transmembranal y la medición simultánea de las corrientes iónicas que atraviesan las proteínas formadoras de poros integradas.
<img alt="Diagrama de canal iónico en bicapa lipídica; configuración de electrofisiología; análisis de estados del canal cerrado/abierto." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig1.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Esquema del montaje electrofisiológico de bicapa lipídica plana (PLB). Un esquema de los componentes esenciales necesarios para los experimentos de PLB. La cámara de registro consta de dos compartimentos acuosos (cis y trans) separados por un septo lipofílico que contiene una abertura en la que se forma una bicapa lipídica. Los electrodos de cloruro de plata/plata (Ag/AgCl) están sumergidos en la solución electrolítica de cada compartimento. Un electrodo aplica estímulos de voltaje (por ejemplo, ondas sinusoidales, cuadradas o triangulares), mientras que el otro, conectado a tierra, se une a un convertidor de corriente a voltaje que transforma la corriente iónica en una señal de voltaje proporcional. La señal se amplifica, opcionalmente se filtra, se digitaliza y se registra para su monitoreo y análisis en tiempo real. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
También se han establecido otros métodos para formar BLMs. Entre ellos, un enfoque común consiste en crear bicapas lipídicas suspendidas en la punta de una pipeta para el registro de parches. Por consiguiente, el método de inmersión en la punta6 permite la formación de una bicapa lipídica libre de solvente suspendida en la abertura de una micropipeta de vidrio con un diámetro de ~4 µm mediante inmersiones repetidas de la punta a través de una monocapa lipídica en la interfase aire–agua, capturando así una sola hoja durante cada paso. La técnica de registro de parches también se ha utilizado para mediciones de canales individuales en bicapas lipídicas. Por ejemplo, en el método de desprendimiento7, se utiliza una pipeta de vidrio con un diámetro entre 10 y 80 µm para sellar una membrana grande originalmente pintada sobre una abertura en una cámara de registro. Alternativamente, el método de liposoma-parche implica el uso de una vesícula preformada de tamaño nano a micro como BLM libre de solvente8,9. En particular, las vesículas unilamelares gigantes se han utilizado ampliamente para registros de canales individuales mediante diferentes configuraciones de registro de parches, incluyendo modos de parche unido a la célula y de parche exciso10,11.
Varias plataformas también han surgido para la formación paralela y automatizada de múltiples bicapas. Uno de estos enfoques es la técnica de bicapa de interfaz de gota (DIB, por sus siglas en inglés)12, en la que se colocan gotas acuosas en una mezcla de lípidos y solvente. En este método, los monocapas lipídicos se ensamblan espontáneamente alrededor de las gotas, y la formación de la bicapa ocurre cuando dos gotas entran en contacto. En algunos montajes, las DIB pueden formarse sobre hidrogeles para mejorar la estabilidad de la membrana13. Un enfoque alternativo basado en la formación de DIB en la punta de una pipeta de vidrio es el método de bicapa de burbujas en contacto (CBB, por sus siglas en inglés)14, donde se introducen burbujas acuosas en una fase oleosa utilizando dos micropipetas. Como en el enfoque DIB, una bicapa lipídica se forma espontáneamente cuando dos burbujas recubiertas de lípidos entran en contacto. Otra plataforma está representada por los sistemas de BLM en arreglo, que consisten en arreglos de poros bien definidos a escala micro- a nanométrica dispuestos en un patrón de cuadrícula. En estos sistemas, las bicapas lipídicas suspendidas pueden formarse manualmente—mediante técnicas de pintado o plegado, o mediante la ruptura de vesículas liposomales15,16,17—o automáticamente mediante la inyección secuencial de soluciones lipídicas y tampón cuando se acoplan con estructuras de canales microfluídicos18,19.
Aunque se han desarrollado muchos métodos para formar bicapas lipídicas libres de solvente, en este trabajo nos centramos en el método de plegado implementado dentro de una plataforma miniaturizada e integrada para investigar el comportamiento de canales individuales de proteínas de membrana incrustadas en una bicapa lipídica artificial. Los experimentos se realizaron utilizando el sistema Elements, que consta de dos componentes: el lector de nanoporos Elements (amplificador eNPR) y el BLMchipMM (Figura 2A y Figura 2B). El primero es un amplificador compacto de bajo ruido que simplifica el espacio de trabajo al formar una unidad completa e independiente, eliminando la necesidad de dispositivos externos adicionales. El BLMchipMM es un sistema preensamblado y miniaturizado diseñado para la técnica de Montal–Mueller y sirve como interfaz experimental. Consiste en una cámara de registro transparente de polimetilmetacrilato (PMMA) integrada con una placa de circuito impreso (PCB), que incluye dos conectores diseñados para alojar alambres de Ag/AgCl que actúan como electrodos para la conexión directa al amplificador. La estructura principal de la cámara consta de un septo de poliimida sellado entre dos componentes transparentes de PMMA. El septo tiene un grosor de 50 µm, excepto en una pequeña región central (3,78 mm2), donde el grosor se reduce a 25 µm para facilitar la formación de la bicapa. En el centro de esta región más delgada, se crea una abertura cónica mediante perforación láser, lo que mejora la estabilidad mecánica de la bicapa lipídica20,21. Se ofrecen cuatro diámetros de abertura (50, 75, 100 y 140 µm), lo que permite ajustar la capacitancia de la membrana (Tabla 1). Cada componente de PMMA presenta una cavidad en forma de C con un volumen de 110 µL, formando dos compartimentos fluidos a ambos lados del septo de poliimida para contener la solución electrolítica. Dos canales fluidos inclinados están perforados en cada bloque de PMMA en lados opuestos: un canal se utiliza para insertar el electrodo de Ag/AgCl, mientras que el otro permite ajustar manualmente el nivel del tampón dentro del depósito mediante pipeteo.
<img alt="Dispositivo microfluídico con compartimento modular; el esquema muestra el lado de PMMA, electrodos y PCB para análisis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Sistema integrado del lector de nanoporos Elements y el BLMchipMM. (A) Fotografía que muestra el BLMchipMM insertado en la ranura dedicada del amplificador lector de nanoporos Elements (eNPR). (B) Representación esquemática de los componentes del BLMchipMM, incluyendo la cámara de registro de polimetilmetacrilato (PMMA), el septo de poliimida que contiene la abertura de tamaño micrométrico y la placa de circuito impreso (PCB) con conectores para electrodos de Ag/AgCl y una ranura para alineación de la cámara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diámetro del orificio (µm)</td>
			<td>50</td>
			<td>75</td>
			<td>100</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Espesor del orificio (µm)</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capacitancia típica de la membrana (pF)</td>
			<td>20–40</td>
			<td>40–60</td>
			<td>60–90</td>
			<td>90–140</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Características de los formatos de apertura disponibles para BLMchipMM. Diámetro del orificio, espesor del septo en la región de la apertura y valores típicos de capacitancia de la membrana para dispositivos BLMchipMM con aperturas de 50, 75, 100 y 140 µm. Los valores de capacitancia de la membrana se muestran para bicapas formadas a partir de lípidos 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine.
Por lo general, las cámaras de registro utilizadas en laboratorios son unidades caseras o dispositivos disponibles comercialmente. En el primer caso, la construcción del sistema implica ensamblar varios componentes y desarrollar un método confiable para crear la abertura en el septo, lo que puede limitar la accesibilidad para muchos laboratorios. Incluso cuando se utilizan dispositivos comerciales, a menudo se requiere la integración manual de múltiples componentes antes de cada experimento. En contraste, el BLMchipMM viene preensamblado y no requiere desmontaje entre experimentos para procedimientos rutinarios de limpieza. La misma unidad puede lavarse y reutilizarse en múltiples experimentos sin comprometer la calidad de la formación de la membrana, siempre que los disolventes utilizados sean compatibles con los materiales del dispositivo. Esto reduce la variabilidad dependiente del usuario y minimiza el riesgo de fugas asociado con elementos de sellado manuales. El uso de electrodos externos de alambre de plata, reemplazables y susceptibles de acondicionamiento, prolonga aún más la vida útil del sistema, especialmente bajo condiciones experimentales que aceleran el consumo del electrodo.
Además, los dispositivos caseros suelen tener compartimentos de gran volumen, lo que aumenta la cantidad de componentes biológicos y químicos necesarios para los experimentos. En contraste, la miniaturización del BLMchipMM permite reducir al mínimo los volúmenes experimentales, reduciendo así significativamente el consumo de reactivos, proteínas y otros compuestos. Esto es particularmente ventajoso al trabajar con proteínas de membrana difíciles de expresar o de bajo rendimiento, o cuando el alto costo de la síntesis de compuestos de prueba incrementa el costo total de los experimentos. Es importante destacar que el BLMchipMM permite la formación de bicapas con mínima cantidad de solvente y soporta configuraciones de membrana asimétricas, en las que cada monocapa puede estar compuesta por diferentes especies de lípidos5,22, facilitando así el estudio de la función de las proteínas de membrana bajo condiciones controladas.
Tradicionalmente, las mediciones de corriente se realizan utilizando amplificadores diseñados para experimentos de registro por parche, que a menudo requieren conexión a un digitizador externo para la adquisición de datos y el control mediante interfaces gráficas. Estos sistemas no solo son voluminosos y costosos, sino que también frecuentemente implican procedimientos de configuración poco intuitivos para usuarios no especializados. Además, debido al tamaño de la cámara de registro y al diseño de los amplificadores estándar, que normalmente carecen de blindaje integrado para proteger la entrada del cabezal contra interferencias electrostáticas, suele ser necesario utilizar una jaula de Faraday externa. La calidad y la conexión a tierra de dicha jaula pueden afectar significativamente el rendimiento del sistema en cuanto al ruido. El BLMchipMM, cuando se utiliza con un amplificador integrado compacto, simplifica esta configuración al reducir la necesidad de componentes externos. La digitalización de la señal ocurre dentro del dispositivo, y la carcasa del sistema proporciona un blindaje que disminuye la susceptibilidad a las interferencias electromagnéticas ambientales.
Para demostrar la aplicabilidad de esta plataforma, se utilizó el canal tipo K2P ancTREK1, un miembro ancestral derivado computacionalmente de la subfamilia TREK (Figura Suplementaria 1), como proteína de prueba para validar la reconstrucción exitosa y el registro de canales individuales. Los canales K2P forman canales de fuga de potasio diméricos que regulan el potencial de membrana en reposo y la excitabilidad celular, siendo los canales TREK una subfamilia bien caracterizada.

<table><tbody><tr><td>1,2-difitanoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>Formación de bicapas lipídicas artificiales</td></tr><tr><td>2-propanol (&amp;ge;99,5 %)</td><td>Honeywell</td><td>24137-5L</td><td>Limpieza del dispositivo BLMchipMM</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Preparación de geles de agarosa</td></tr><tr><td>Sistema horizontal de electroforesis en gel de agarosa</td><td>BTLabSystems</td><td>BT102</td><td>Separación de fragmentos de ADN</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1760-25</td><td>Selección de bacterias transformadas</td></tr><tr><td>Resina de Sepharosa con nanocuerpo anti-GFP (casera)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Purificación por afinidad de proteínas marcadas con GFP</td></tr><tr><td>Fosfatasa alcalina Anza</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2208</td><td>Desfosforilación del vector</td></tr><tr><td>Anza EcoRI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0116</td><td>Digestión con enzimas de restricción</td></tr><tr><td>Anza NotI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0014</td><td>Digestión con enzimas de restricción</td></tr><tr><td>Buffer rojo Anza (10&amp;times;)</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2008</td><td>Buffer para digestión con enzimas de restricción</td></tr><tr><td>Inhibidor de proteasas aprotinina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15996008</td><td>Prevención de la degradación proteica</td></tr><tr><td>Centrífuga de banco</td><td>Eppendorf</td><td>EP5420000164</td><td>Formación de pellet celular y preparación de muestras</td></tr><tr><td>BLMchipMM</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Formación de bicapas lipídicas planas</td></tr><tr><td>Hemisuccinato de colesterol (CHS)</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>Estabilización de proteínas de membrana</td></tr><tr><td>Azul brillante de Coomassie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1125530025</td><td>Tinción de proteínas</td></tr><tr><td>Lejía doméstica común</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Cloración de alambres de Ag</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>Reducción de la viscosidad del lisado</td></tr><tr><td>Agua doblemente destilada</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Preparación de tampones y soluciones</td></tr><tr><td>Etileno (puro, 99,9 %)</td><td>Girelli Alcool s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Limpieza de alambres Ag/AgCl</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1116080030</td><td>Tinción de ADN</td></tr><tr><td>Papel de lija de grano extrafino</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Eliminación del recubrimiento Ag/AgCl de los alambres</td></tr><tr><td>Amplificador eNPR de 100 kHz</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Grabación electrofisiológica</td></tr><tr><td>Kit Gel-Out para extracción de ADN de agarosa</td><td>A&amp;amp;A Biotechnology</td><td>023-250</td><td>Purificación de ADN</td></tr><tr><td>Escalera de ADN GeneRuler de 1 kb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>Referencia de tamaño de ADN</td></tr><tr><td>FreeStyle&amp;trade; 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>Expresión de la proteína ancTREK1</td></tr><tr><td>HEPES (&amp;ge;99,5 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Agente tampón</td></tr><tr><td>Hexadecano (&amp;ge;99 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6703-100ML</td><td>Pretatamiento de la abertura</td></tr><tr><td>Hexano (&amp;ge;99 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386-100ML</td><td>Disolvente lipídico</td></tr><tr><td>Tinte casero de carga de ADN 5&amp;times;</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Preparación de muestras de ADN</td></tr><tr><td>Tampón Laemmli SDS casero 6&amp;times; (reductor)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Preparación de muestras proteicas</td></tr><tr><td>Solución casera de decoloración</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Decoloración de geles SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Proteasa HRV-3C casera</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Cleavage de proteínas de fusión</td></tr><tr><td>Tampón de marcha SDS-PAGE casero (10&amp;times;)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Tampón para electroforesis SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10221</td><td>Elución de proteínas con etiqueta His</td></tr><tr><td>Columnas de purificación por lote</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Flujos de trabajo de purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Incubadora agitadora Innova44</td><td>New Brunswick Innova</td><td>M1282</td><td>Crecimiento de cultivos celulares</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>31248-1KG</td><td>Preparación de electrolitos y tampones</td></tr><tr><td>Caldo LB (Lennox)</td><td>Condalab</td><td>1231</td><td>Cultivo bacteriano</td></tr><tr><td>Inhibidor de proteasas leupeptina</td><td>Thermo Scientific</td><td>78435</td><td>Prevención de la degradación proteica</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Acros Organics</td><td>447700010</td><td>Componente del tampón</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Nanodrop</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td>Cuantificación de ADN y proteínas</td></tr><tr><td>n-Dodecil-&amp;beta;-D-maltósido (DDM)</td><td>NeoBiotech</td><td>NB-19-0056-25G</td><td>Solubilización de proteínas de membrana</td></tr><tr><td>Resina Ni Sepharose High Performance</td><td>Cytiva</td><td>17526801</td><td>Purificación IMAC</td></tr><tr><td>Portátil (ordenador)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Control de instrumentos y adquisición de datos</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima LE-80K</td><td>Beckman</td><td>365668</td><td>Aislamiento de fracciones de membrana</td></tr><tr><td>Pentano (&amp;ge;99 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236705-100ML</td><td>Disolvente lipídico</td></tr><tr><td>Inhibidor de proteasas pepstatina A</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>Prevención de la degradación proteica</td></tr><tr><td>Tampón Phusion GC (5&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F519</td><td>Tampón para PCR</td></tr><tr><td>ADN polimerasa Phusion de alta fidelidad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Amplificación por PCR</td></tr><tr><td>Inhibidor de proteasas PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Protección de proteínas durante la lisis</td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Clinisciences</td><td>24765-100</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Gel precolado ProteinEle Tris-Glicina (4&amp;ndash;20 %)</td><td>TransGen Biotech</td><td>DG101-01-V2</td><td>Separación de proteínas</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis en gel SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658002FC</td><td>Electroforesis de proteínas</td></tr><tr><td>Butirato sódico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11079</td><td>Potenciador de la expresión proteica</td></tr><tr><td>Ligasa T4 de ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>Ligación de ADN</td></tr><tr><td>Tampón para ligasa T4 de ADN (10&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B69</td><td>Tampón de ligación</td></tr><tr><td>Ciclador térmico (Mastercycler Nexus)</td><td>Eppendorf</td><td>6331000025</td><td>Amplificación por PCR</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td>Preparación de tampones</td></tr><tr><td>Agar triptona soya con lecitina y polisorbato 80</td><td>HiMedia</td><td>M449-5KG</td><td>Plaqueo bacteriano</td></tr><tr><td>Dos alambres de Ag</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Electrodos para electrofisiología</td></tr><tr><td>Concentrador ultracentrífugo (corte de 50 kDa)</td><td>Merck Amicon</td><td>UFC8050</td><td>Concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Vector de expresión pEG BacMam</td><td>Addgene</td><td>160687</td><td>Expresión de proteínas</td></tr><tr><td>Cable USB</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Conexión entre amplificador y ordenador</td></tr></tbody></table>

electrofisiología de un solo canal utilizando un sistema miniaturizado de bicapa lipídica planar montal-mueller para registrar un canal k2p sintético

Single-Channel Electrophysiology Using a Miniaturized Montal&#8211;Mueller Planar Lipid Bilayer System for Recording a Synthetic K2P Channel

La reconstrucción funcional de canales iónicos en bicapas lipídicas planas proporciona una estrategia para investigar la actividad del canal a nivel de molécula individual. Sin embargo, los sistemas convencionales de bicapa de Montal–Mueller generalmente requieren configuraciones experimentales voluminosas, ensamblaje manual de cámaras y volúmenes de registro relativamente grandes, lo que incrementa el consumo de reactivos y puede introducir fuentes adicionales de ruido eléctrico debido a conexiones alargadas y etapas externas de preamplificación. Aquí presentamos una plataforma de bicapa miniaturizada y lista para usar (BLMchipMM) integrada con un amplificador compacto que permite grabaciones estables de canales individuales con menor consumo de reactivos y una operación simplificada. Este protocolo describe el uso de este sistema para realizar mediciones de electrofisiología de canal individual. Mediante este sistema, reconstruimos un canal sintético K2P (ancTREK1) y lo utilizamos como proteína de prueba de principio para validar la reconstrucción y la grabación de canal individual. Las grabaciones de canal único muestran una relación corriente–voltaje en soluciones simétricas de K+ sin Mg2+, con valores de conductancia consistentes con los reportados para los canales TREK1. La reconstrucción exitosa de este canal similar a K2P demuestra la utilidad de este sistema para el análisis de canales individuales en membranas artificiales.

Características corriente–voltaje (I–V) de membranas PLB
La naturaleza hidrofóbica intrínseca de las membranas bicapa las hace impermeables a las especies cargadas. Sin embargo, la aplicación de un campo eléctrico externo puede inducir la formación de poros transitorios de tamaño nanométrico, afectando así la permeabilidad y la conductancia de la membrana33. Para evaluar la calidad de las bicapas artificiales formadas a partir de lípidos de 1,2-difitanoil-sn-glicerol-3-fosfocolina, se analizaron la capacitancia, la resistencia y las características corriente–voltaje de la membrana en ausencia de proteínas insertadas. Se aplicó una serie de escalones de voltaje que variaron desde ±20 hasta ±200 mV (en incrementos de ±20 mV) y se registraron las corrientes transmembrana resultantes. Los datos se muestrearon a 5 kHz y se filtraron con paso bajo a 2,5 kHz.
La capacitancia de la membrana (Cm) y la resistencia de la membrana (Rm) representan parámetros clave para evaluar la calidad de la bicapa. La PLB puede describirse mediante un circuito equivalente resistor-condensador (RC), en el cual la membrana se comporta como un condensador en paralelo con un resistor34. El componente capacitivo refleja la capacidad de la membrana para almacenar carga, mientras que el componente resistivo refleja la permeabilidad a iones. La aplicación de una forma de onda de voltaje triangular genera una respuesta de corriente capacitiva de forma cuadrada, que es proporcional a la capacitancia de la membrana según:
<img alt="Fórmula de corriente capacitiva I_c=C_m(dv/dt), que ilustra el análisis de circuitos eléctricos." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Ecuación 1">    (1)
Aquí, Cm es la capacitancia de la membrana, V es el voltaje aplicado y t es el tiempo. Tras la formación de la membrana, los valores de capacitancia pueden aumentar con el tiempo debido al adelgazamiento progresivo de la bicapa35. Considerando la membrana como un capacitor de placas paralelas, la capacitancia se relaciona con el área y el grosor de la membrana según:
<img alt="Fórmula de capacitancia con lípidos, ecuación, diagrama educativo, constante dieléctrica." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Ecuación 2">    (2)
Aquí, εlipids es la constante dieléctrica del núcleo lipídico (~2), ε0 es la permitividad del espacio libre, A es el área de la membrana, y d es el grosor de la membrana36,37.
La resistencia de la membrana se determinó utilizando la ley de Ohm33:
<img alt="Ecuación de fuerza electromotriz Ir=V/Rm, diagrama educativo para la resistencia eléctrica." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Ecuación 3">    (3)
Aquí, V es el voltaje aplicado y Rm es la resistencia de la membrana. En ausencia de canales iónicos, la corriente de la membrana permanece cerca de 0 pA, lo que corresponde a valores de resistencia en el rango de gigaohmios (GΩ)33.
La relación I-V mostró un comportamiento lineal (óhmico) entre 0 y ±200 mV para los dispositivos BLMchipMM con aperturas de 75 y 100 µm. El ajuste lineal de los datos arrojó valores de resistencia de la membrana de 847 ± 16 GΩ (n = 6) para la apertura de 75 µm (Figura 8A, círculos) y de 980 ± 32 GΩ (n = 7) para la apertura de 100 µm (Figura 8A, cuadrados). Los valores de ruido RMS, medidos en segmentos de 3 s del trazado de corriente, fueron de 3,1 ± 2 pA (n = 7) para la apertura de 100 µm y de 2,6 ± 0,1 pA (n = 6) para la apertura de 75 µm. La estabilidad de la membrana se evaluó midiendo la resistencia a intervalos aproximados de 2 min durante una duración total de 1 h (Figura 8B). Las membranas bien formadas permanecieron estables consistentemente durante más de 1 h, lo cual es suficiente para la mayoría de los experimentos electrofisiológicos. Las membranas generalmente toleraron potenciales aplicados hasta ±200 mV sin signos de inestabilidad, mientras que la ruptura ocurrió entre ±220 y ±300 mV dependiendo de la bicapa individual. Se consideró que las membranas eran adecuadas para la inserción de proteínas cuando los valores de capacitancia oscilaron entre 40 y 60 pF para aperturas de 75 µm y entre 60 y 90 pF para aperturas de 100 µm, con valores de corriente de ≤0,5 pA a 100 mV.
<img alt="Gráficos de voltaje-corriente y resistencia-tiempo, estudio de chip de membrana bicapa, resultados del análisis de datos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig8.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 8"> 
Figura 8: Caracterización eléctrica de las BLPs. (A) Relaciones corriente–voltaje (I–V) de bicapas formadas sobre aperturas de 75 µm y 100 µm, que demuestran un comportamiento lineal (óhmico) entre ±200 mV. El ajuste por regresión lineal arroja valores de resistencia de la membrana de 847 ± 16 GΩ (n = 6) y 980 ± 32 GΩ (n = 7), respectivamente. (B) Estabilidad de la membrana evaluada mediante el seguimiento de la resistencia durante 1 h a intervalos de 2 min. Las membranas permanecen estables hasta ±200 mV y se rompen a voltajes comprendidos entre ±220 y ±300 mV. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Caracterización inicial del comportamiento de canales individuales de ancTREK1
Se purificó ancTREK1 sintético y se reconstituyó en bicapas de lípidos planas (PLB), y se monitoreó la actividad de canales individuales mediante protocolos de escalones de voltaje que variaron de −120 a 120 mV en incrementos de 20 mV. Los registros de canal individual (Figura 9A y Figura 9B) revelaron el comportamiento característico de parpadeo de los canales K2P38. A 80 mV, la amplitud media de la corriente fue de 13,02 ± 0,78 pA (n = 5), mientras que a −80 mV la amplitud de la corriente aumentó a −18,72 ± 0,25 pA (n = 5) (Figura 9C). La relación I–V resultante mostró corrientes de canal individual medibles a potenciales tanto positivos como negativos en condiciones simétricas de potasio 200 mM sin Mg2+ (Figura 9D). Dado que las amplitudes de corriente se estimaron a partir de histogramas de todos los puntos de grabaciones adquiridas a 5 kHz y filtradas de bajo paso a 2,5 kHz, esta relación I–V se presenta como una demostración descriptiva de principio más que como una caracterización biofísica exhaustiva.
<img alt="Análisis de la actividad del canal iónico; gráfico de trazas de corriente e histogramas de amplitud a +80 mV, -80 mV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig9v2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 9"> 
Figura 9: Actividad unitaria del canal ancTREK1 sintético. (A y B) Trazas representativas de corriente unitaria registradas a 80 mV y −80 mV, respectivamente. Las líneas punteadas indican el nivel del canal cerrado. (C) Histogramas de amplitud de todos los puntos para potenciales positivos (izquierda) y negativos (derecha). (D) Relación I–V de ancTREK1 en condiciones simétricas de 200 mM de potasio (K+) sin cationes divalentes. La curva se ajusta mediante un polinomio de cuarto orden, y los valores de conductancia se derivan de la pendiente a ±80 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig9largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Aunque ancTREK1 carece de regiones N-terminal y C-terminal extendidas en comparación con los canales TREK1 de mamíferos, permaneció funcionalmente activo tras la reconstitución. A diferencia de TREK1 de mamíferos, que exhibe modos de alta y baja conductancia (132 ± 5 pS y 41 ± 5 pS a potenciales positivos, respectivamente)39, ancTREK1 mostró únicamente el modo de alta conductancia. La conductancia unitaria a potenciales positivos fue de 112,8 ± 10,8 pS (80 mV, n = 5), consistente con los valores reportados para los canales TREK (85–130 pS bajo condiciones simétricas de potasio)38,39,40,41. A potenciales negativos, la conductancia aumentó a 205,6 ± 2,05 pS (−80 mV, n = 5), en concordancia con el comportamiento previamente descrito para TREK139. Notablemente, ancTREK1 exhibió una probabilidad de apertura normalizada (NPo) más alta en comparación con las mediciones de TREK1 obtenidas mediante configuraciones de parche exciso42. La relación NPo–voltaje mostró una mayor actividad del canal a potenciales positivos, alcanzando 0,78 ± 0,02 (n = 5) a 80 mV. En contraste, la NPo disminuyó a potenciales negativos, con valores de 0,53 ± 0,04 a −80 mV y 0,28 ± 0,03 a −120 mV (Figura 10).
<img alt="Resultados de electrofisiología de canales iónicos, gráfica de NPo frente a voltaje (mV), comparación en gráfico de barras, análisis de datos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig10.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 10"> 
Figura 10: Análisis de la dependencia del voltaje en la actividad unitaria del canal ancTREK1. Probabilidad de apertura normalizada (NPo) en función del potencial de membrana (izquierda) y comparación de NPo a 80 mV y −80 mV (derecha), que muestra un aumento en la apertura del canal a potenciales positivos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria 1. Secuencia de aminoácidos del canal de potasio sintético ancestral de dos dominios de poro (K2P) (ancTREK1). La secuencia de aminoácidos completa de ancTREK1 utilizada para las grabaciones electrofisiológicas. La secuencia fue reconstruida mediante inferencia de secuencia ancestral a partir de un conjunto de datos curado de miembros de la familia TREK/TRAAK, que incluye secuencias ortólogas obtenidas de las bases de datos UniProt y NCBI, filtradas por motivos de poro conservados, alineadas y analizadas mediante filogenética de máxima verosimilitud.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo describe el uso de un sistema miniaturizado de bicapa lipídica planar de Montal–Mueller con amplificación integrada para realizar grabaciones estables de un solo canal. El método se demuestra reconstituyendo un canal K2P sintético purificado para validar el rendimiento del sistema.

Electrofisiología de un solo canal utilizando un sistema miniaturizado de bicapa lipídica planar Montal-Mueller para registrar un canal K2P sintético

La reconstitución funcional de canales iónicos en bicapas lipídicas planas proporciona una estrategia para investigar la actividad de los canales a nivel de molécula individual.

Nuestra investigación se centra en comprender cómo funcionan los canales iónicos y los transportadores mediante técnicas integradas de biología estructural y electrofisiología. Los montajes convencionales de bicapa requieren instrumentación compleja y ensamblaje manual, mientras que esta plataforma es miniaturizada, lista para usar e integra un amplificador compacto.Para comenzar, prepare el montaje de electrofisiología realizando la calibración del instrumento y preparando los electrodos de plata o cloruro de plata. Inserte los extremos no clorados de los dos alambres de plata en los conectores de la placa de circuito impreso o PCB. Coloque los extremos clorados de los alambres en los canales fluidicos perforados en el componente de polimetilmetacrilato o PMMA. Gire suavemente el chip de membrana lipídica negra o BLMchipMM y colóquelo sobre el PCB ajustando el diente inferior de la cámara de registro PMMA en la ranura correspondiente. Asegúrese de que el alambre alcance el extremo de los canales fluidicos. Prepare 100 microlitros de una solución al 1% volumen por volumen de hexadecano en n-hexano al 100% para el pretratamiento del septo. Re_suspenda los lípidos 1,2-difitanoil-sn-g

single-channel-electrophysiology-using-miniaturized-montalmueller

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Electrofisiología de un solo canal utilizando un sistema miniaturizado de bicapa lipídica planar Montal-Mueller para registrar un canal K2P sintético (Video) | JoVE Journal

Electrofisiología de un solo canal utilizando un sistema miniaturizado de bicapa lipídica planar Montal-Mueller para registrar un canal K_2P sintético

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