Experimentos de inmunotinción y penetración de colorantes para definir proteínas de unión septata plisadas en el núcleo en epitelios embrionarios de Drosophila

Nuestra investigación investiga las funciones no ocluidoras del desarrollo de las proteínas de unión septato, centrándose en identificar y caracterizar nuevos componentes implicados en la estructura y los roles biológicos. Este protocolo pretende caracterizar la organización y función ocluiente de las uniones septadas plisadas en los epitelios ectodérmicos de los embriones de Drosophila. Para empezar, cruza moscas Drosophila macho y hembra sanas con los genotipos adecuados y colócalas en jaulas de recogida de embriones con platos frescos de zumo de manzana untados con pasta de levadura.

Permite que los adultos pongan huevos fertilizados en los platos de zumo de manzana. Retirar la placa de la jaula de recogida de huevos y envejecer los embriones durante 13 a 16 horas después de la puesta a 25 grados Celsius para alcanzar la etapa 16. Después, fijar los embriones en estadio 16 en una solución fijadora adecuada y realizar la inmunotinción con los anticuerpos deseados.

Para obtener los mejores resultados, fotografía de los embriones con un microscopio confocal con un objetivo de inmersión en aceite de 40 veces. Después de enfocar el embrión de interés, ajusta la intensidad y ganancia láser para lograr una señal fluorescente fuerte sin saturar ningún píxel. Identifica embriones en estadio 16 que no expresen proteína fluorescente verde codificada por el balanceador, utilizando la morfología del intestino medio.

Enfocar la exploración en la glándula salival o en el intestino posterior, y posicionar la Z-scan para incluir el mayor diámetro posible de la luz y así visualizar la membrana lateral completa de la célula epitelial. Establezca un promedio lineal adecuado e visualiza un tejido polarizado en al menos 20 embriones control y 20 embriones Cora 4 mutantes en estadio 16. Registrar datos solo de embriones en los que el marcador de la unión de adherencia esté estrechamente localizado en la región apical-lateral de la membrana.

En embriones de tipo salvaje en estadio 16, se evalúa el enriquecimiento de proteínas de la unión septato plisada a lo largo de la región apical de la membrana lateral cerca de la unión adherente. Registra la distribución persistente del marcador de unión del septo plisado a lo largo de toda la membrana lateral del mutante. Elabora una solución de colorante fresca disolviendo dextrán de 10 kilodaltón marcado con rodamina a 1 miligramo por mililitro en fosfato de sodio molar de 0,5 molares a pH 7,5, con cloruro de potasio de 5 milimolares.

Usando un extractor de agujas, tira un tubo capilar de 1 milímetro de diámetro exterior por 0,5 milímetros de diámetro interior con fibra, dentro de una aguja de vidrio. A continuación, carga la aguja de cristal en el soporte de un micromanipulador y coloca el micromanipulador junto a un microscopio invertido. Orienta la aguja lo más paralela posible al portaobjetos del microscopio y bájala al mismo plano Z que el lateral del portaobjetos.

Rompe la punta de la aguja golpeándola contra el lateral del portaobjetos del microscopio. Eleva la aguja por encima del nivel de la lámina y sácala para cargarla. A continuación, llena el tubo capilar con tinte usando la punta de pipeta más pequeña disponible.

Recarga la aguja llena en el portaagujas. Prueba el flujo del dextrán de 10 kilodaltón inyectando una pequeña cantidad en una gota de aceite de halocarbono sobre la superficie de una lámina de microscopio. Usando una cubierta de 22 x 22 milímetros de grosor número 2, crea una línea hundida en un plato de zumo de manzana.

Alinear aproximadamente 25 embriones de control y Cora 4 mutantes en las etapas 16 o 17 en la placa de zumo de manzana. Asegúrate de que sus extremos posteriores estén alineados a lo largo de la línea y que las superficies ventrales estén orientadas hacia arriba. Luego aplica un trozo de cinta adhesiva de doble cara a una cubierta número 2 de 22 x 22 milímetros.

Toca la cinta con la línea del embrión y frota suavemente la capa de la cubierta para transferir los embriones de la placa a la cinta de doble cara. A continuación, añade una gota de aceite de halocarbono a una lámina de microscopio y fije la lâmina de la cubierta a la lámina permitiendo que la acción capilar cree una unión. Orienta la cubierta más cerca del lado del tobogán opuesto a cualquier parte esmerilada.

Deseca los embriones durante tres a cinco minutos en un recipiente de desecante y cúbrelos completamente con aceite de halocarbono. Monta el portaobjetos con los embriones sobre el microscopio invertido con los embriones orientados hacia arriba y alejados del objetivo. Alinea el micromanipulador de modo que la aguja mire hacia el extremo posterior de los embriones en un ángulo lo más paralelo posible a los embriones, y ajusta el eje Z del micromanipulador para que la punta de la aguja se alinee con el punto medio del embrión a lo largo del eje dorsal-ventral.

A continuación, inyecta los embriones moviendo rápidamente la etapa hacia la aguja para que la punta de la aguja entre en el hemocel. Inyecta aproximadamente entre 0,2 y 0,5 nanolitros de tinte usando una jeringuilla de 10-25 o 50 mililitros. Retira rápidamente la aguja y mueve la etapa al siguiente embrión para la inyección del colorante.

Luego añade aceite de halocarbono adicional sobre los embriones. Cubre los embriones con un engobe de cubierta número 2 de 22 x 22 milímetros para crear una capa uniforme de aceite entre los deslizamientos y evitar que se aplasten. Realizar imágenes con un microscopio compuesto fluorescente o un microscopio confocal tras la inyección de tinte dextrano.

En el microscopio confocal, adquiere un pila en Z a lo largo de aproximadamente una cuarta parte de la profundidad del embrión a lo largo del eje dorsal-ventral para evaluar la luz de la tráquea. Examina la luz de la tráquea, una glándula salival o el intestino posterior para detectar acumulación de dextras marcados. Registrar el genotipo y la etapa de desarrollo de cada embrión y si el dextrano marcado se acumula en algún órgano tubular.

Fíjate en embriones en los que el espacio perivitelino está fuertemente teñido con tinte, ya que estos pueden representar una inyección involuntaria en ese espacio. En embriones de tipo salvaje, el complemento relacionado con macroglobulina, o Mcr, se localizó uniformemente a lo largo de la membrana lateral en la etapa 13, se enriqueció en la región apical de la membrana lateral en la etapa 14 y se localizó fuertemente en la región apical-lateral, justo basal a la unión adherente en la etapa 16. La tinción cortical por anticuerpos definió las uniones septadas plisadas maduras en embriones de tipo salvaje en estadio 16, de forma similar a Mcr.

En embriones mutantes de Cora 4, Mcr no logró una fuerte localización apical en la etapa 16 y permaneció distribuido a lo largo de la membrana lateral. La localización de E-cadherina fue similar en embriones tipo salvaje y en Cora 4 mutante en estadio 16. En embriones de tipo salvaje en estadio 17 inyectados con dextran de 10 kilodaltón marcado con rodamina, el contraste rodeaba la tráquea pero no penetraba la luz.

En embriones de Cora 4 mutantes en estadio 17, el contraste se acumuló en el lumen de la tráquea en menos de 10 minutos tras la inyección. Este protocolo permite a los investigadores determinar con confianza si un gen codifica el núcleo o el componente accesorio de las uniones septadas plisadas en los tejidos embrionarios de Drosophila. La estadificación embrionaria es absolutamente crucial al realizar esta técnica, ya que requiere embriones en etapa 16.

Las uniones septadas maduran con el tiempo hasta que se establecen completamente en la etapa 16. Creemos que este protocolo puede implementarse eficazmente en cribado genético abierto utilizando líneas de interferencia de ARN para identificar nuevos genes de unión septato plisada.