Name: El ensayo de mamosera revela el tallo inducido por Api5 en líneas celulares epiteliales mamarias no tumorígenas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprende a evaluar propiedades de células madre cancerosas en células epiteliales mamarias no tumorígenas mediante el ensayo de mamosferas con sobreexpresión de Api5. Este protocolo permite cuantificar la formación de mamosferas y la capacidad de autorrenovación in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Recubrimiento de placas de cultivo de tejidos con poli(2-hidroxietilmetacrilato), pHEMA
<ol>
	<li>Disolver 1,2 g de pHEMA (peso molecular ̴ 300.000) en 100 mL de etanol al 95% removiendo constantemente a 65 °C para preparar una solución de pHEMA al 1,2% (véase Tabla de Materiales).</li>
	<li>Recubre las placas estándar de cultivo de tejidos con pHEMA aplicando 1 mL por pozo de una placa de 6 pozos. El volumen de la solución de pHEMA puede ajustarse en función del tamaño del vaso de cultivo tisular.</li>
	<li>Deja que los platos se sequen en un horno a 40 °C en condiciones estériles.</li>
	<li>Expone las placas a la luz ultravioleta durante 15 minutos, seguidas de tres lavados con la solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, antes de usarlas para preparar el ensayo de formación de la mamosfera.</li>
</ol>
2. Siembra de mamósferas de generación primaria
<ol>
	<li>Cultivo de células MCF10A disociadas en 3D (control y sobreexpresión de Api5) obtenido disociando cultivos 3D del día 16 en el mediode crecimiento 14. NOTA: Composición del medio de crecimiento: DMEM de glucosa alta sin piruvato de sodio suplementado con suero de caballo al 5%, 10 μg/mL de insulina, 0,5 μg/mL de hidrocortisona, 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF), 100 ng/mL de toxina cólera y 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina (véase Tabla de Materiales).</li>
	<li>Retira el medio gastado, lava las células con 1 mL de DPBS, luego añade 500 μL de tripsina-EDTA al 0,05% e incuba a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 12-15 minutos hasta que todas las células estén tripsinizadas.</li>
	<li>Después de que todas las células se hayan desplazado, añade 2 mL de medio de resuspensión para neutralizar la actividad de la tripsina y centrifuga la suspensión celular a 112 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Composición del medio de resuspensión: DMEM de alta glucosa sin piruvato de sodio suplementado con suero de caballo al 20% y 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Aspira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet celular en 1 mL de medio mamosférico. Pasa la suspensión de la celda por una aguja de 25 G para obtener una suspensión de una sola celda. NOTA: Composición del medio mamósfero: DMEM/F12 suplementado con 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 1 suplemento × B27 sin vitamina A y 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina (véase Tabla de Materiales).</li>
	<li>Utilizando un hemocitometro, cuenta el número de células y calcula el volumen de suspensión celular necesario para sembrar 0,2 × 104 células por pozo. NOTA: Mantener una baja densidad de siembra para determinar con precisión la eficiencia de formación de la mamósfera, minimizando así el impacto de la agregación celular. Al recoger lisados proteicos para la inmunoabsorbción, la densidad celular puede aumentar hasta 2,5 × 105 células por pozo.</li>
	<li>Diluir el volumen de suspensión celular requerido en 2 mL de medio mamosférico y sembrar en cada pozo de una placa de 6 pozos. Las células semilla en triplicado para cada condición.</li>
	<li>Incubar a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 7 días.</li>
	<li>Tras siete días de cultivo, se cuenta manualmente el número de mamosferas con un diámetro superior a 50 μm en cada pozo, ya sea utilizando un microscopio equipado con un grátículo o una cuadrícula de cuadrantes bajo un microscopio óptico.</li>
	<li>Fotografía las mamosferas usando una cámara digital instalada en un microscopio óptico a una ampliación de 20x.</li>
	<li>Calcular la eficiencia de formación de la mamosfera (MFE) usando la siguiente fórmula5 
	 <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq1v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
3. Siembra de mamósferas de generación secundaria
<ol>
	<li>Recoge las mamosferas formadas en la primera generación en un tubo de 15 mL y centrifuga a 300 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspira el sobrenadante, dejando atrás la pelota de mamosífera.</li>
	<li>Lava el pellet con DPBS.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tripsina-EDTA al 0,05% al pellet de la mamosfera e incubar a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 2-3 minutos. Pasar las mamosferas en la solución de tripsina a través de una aguja de 25 G tres veces para obtener una suspensión de célula única.</li>
	<li>Añade 0,5 mL de medio de resuspensión para neutralizar la actividad de la tripsina y centrifuga la suspensión celular a 112 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet celular en 0,5 mL de medio mamosférico.</li>
	<li>Utilizando un hemocitómetro, cuenta el número de células y calcula el volumen de suspensión celular necesario para sembrar 0,2 × 104 células por pozo. NOTA: Mantener una baja densidad celular para evaluar la capacidad de autorrenovación, minimizando así el efecto de la agregación celular.</li>
	<li>Diluir el volumen de suspensión celular requerido en 2 mL de medio mamosférico y sembrar en cada pozo de una placa de 6 pozos. Las células semilla en triplicado para cada condición.</li>
	<li>Incubar a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 7 días.</li>
	<li>Tras 7 días en cultivo, cuenta el número de mamosferas con un diámetro superior a 50 μm en cada placa utilizando un microscopio equipado con un graticule o una cuadrícula de cuadrantes.</li>
	<li>Fotografía las mamosferas usando una cámara digital instalada en un microscopio óptico a una ampliación de 20x.</li>
	<li>Calcula la capacidad de autorrenovación usando la siguiente fórmula5 
	<img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq2v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
4. Western blot para detectar los cambios en los marcadores de pluripotencia tras la sobreexpresión de Api5
<ol>
	<li>Recoge las mamosferas formadas en la primera generación en un tubo de 15 mL y centrifuga a 300 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspira el sobrenadante, dejando atrás la pelota de mamosífera.</li>
	<li>Lava el pellet con DPBS.</li>
	<li>Recoger el pellet en un tampón RIPA helado para obtener el lisato proteico y realizar inmuno-absorbente según el protocoloestándar 24. NOTA: Composición del tampón RIPA: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% Tritón X-100, 0,5% desoxicolato sódico, 0,1% dodecilo sulfato sódico (SDS), 1 mM de ácido etilenediaminotetraacético (EDTA), 1 mM de fluoruro fenilmetilsulfonilo (PMSF), 10 mM de fluoruro de sodio, 1 mM de ortovanato sódico.</li>
	<li>Prueba los marcadores de tallo - Oct3/4, Nanog, Sox2 y Bmi1, y el control de carga GAPDH (véase la Tabla de materiales para diluciones de anticuerpos).</li>
	<li>Cuantifiquen los niveles de proteínas usando análisis densitométrico en ImageJ. Selecciona la región de interés en las imágenes de Western blot y genera un perfil de densidad para cada carril.</li>
	<li>Normalizar las densidades relativas de la proteína de interés respecto a las de GAPDH para cada carril. Calcula el cambio de pliegue para cada proteína.</li>
	<li>Grafica el cambio de pliegue en los niveles de proteínas usando cualquier software de trazado.</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).</li>
<li>Creighton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Kim, R. J., Nam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCT4+expression+enhances+features+of+cancer+stem+cells+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer.</a> Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotency+factor+nanog+promotes+breast+cancer+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis.</a> Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Paranjape, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+self-renewal+and+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+breast+cancer+cells+through+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog.</a> BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).</li>
<li>Bousquet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+apoptosis+protein+%28Api-5%29+in+chemoresistant+triple-negative+breast+cancers%3A+an+innovative+target%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target.</a> Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).</li>
<li>Basset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Api5+a+new+cofactor+of+estrogen+receptor+alpha+involved+in+breast+cancer+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome.</a> Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).</li>
<li>Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+anti-apoptotic+protein+Api5+affects+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis.</a> BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor-5+overexpression+is+associated+with+tumor+progression+and+poor+prognosis+in+patients+with+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer.</a> BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).</li>
<li>Jang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+induces+cisplatin+resistance+through+FGFR+signaling+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells.</a> Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+increases+metastasis+via+Erk-mediated+MMP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression.</a> BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).</li>
<li>Krejci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiapoptotic+protein+Api5+and+its+partner%2C+high+molecular+weight+FGF2%2C+are+up-regulated+in+B+cell+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia.</a> J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).</li>
<li>Koci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+%28API-5%3B+AAC-11%3B+FIF%29+is+upregulated+in+human+carcinomas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo.</a> Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).</li>
<li>Phi, L. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+%28CSCs%29+in+drug+resistance+and+their+therapeutic+implications+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment.</a> Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).</li>
<li>Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+for+reversing+therapy+resistance%3A+mechanism%2C+signaling%2C+and+prospective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+confers+cancer+stem+cell-like+properties+through+the+FGF2-NANOG+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis.</a> Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3Aa+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Eyre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+mammosphere+and+xenograft+tumour+initiation+correlates+with+progression+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C humidified incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bmi1 Rabbit pAb</td><td>ABclonal</td><td>A13472</td><td>1:1000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>Sigma</td><td>G9545-200UL</td><td>1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Rabbit mAb</td><td>ABclonal</td><td>A22625</td><td>1:5000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Oct3/4 Antibody (C-10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antibody (E-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365823</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamin A</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td>&nbsp;1 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>100 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>Ethanol absolute 99.9%</td><td>Jebsen &amp; Jessen GmbH &amp; Co. Germany</td><td>58051 L05</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM without sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q29145</td><td>Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr><tr><td>Hydrocortisone&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>H0888</td><td>1 mg/mL stock in ethanol</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882&nbsp;</td><td>10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 microscope</td><td>Nikon</td><td>BM-1919</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td></td><td></td><td>Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plotting software&nbsp;</td><td>GraphPad Prism 10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)</td><td>Santacruz</td><td>sc-253284</td><td>1.2% pHEMA in 95% ethanol</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>SRL</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride (NaF)</td><td>HiMedia</td><td>RM1081-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>SRL</td><td>71033</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr></tbody></table>

el ensayo de mamosera revela el tallo inducido por api5 en líneas celulares epiteliales mamarias no tumorígenas

Mammosphere Assay Reveals Api5-Induced Stemness in Non-Tumorigenic Breast Epithelial Cell Lines

Para evaluar la eficiencia de formación de la mamosfera en condiciones no adherentes, se sembraron células MCF10A disociadas en 3D de control y sobreexpresión de Api5 en placas recubiertas de poliHEMA según el protocolo. Las células Api5 que sobreexpresan demostraron un aumento de 1,58 veces en la eficiencia media de formación de la mamosfera que los controles (Figuras 1B,C). Este aumento demuestra que una mayor expresión de Api5 incrementa la proporción de progenitores simi...

El ensayo de mamosera revela el tallo inducido por Api5 en líneas celulares epiteliales mamarias no tumorígenas

Breast cancer remains the most prevalent cancer among women globally, with the highest age-standardised incidence and mortality rates. Despite the ...

mammosphere-assay-reveals-api5-induced-stemness-non-tumorigenic

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video describe el aislamiento de células madre cancerosas de líneas celulares de cáncer de mama. Cultivamos estas células madre cancerosas para generar mamósferas primarias para evaluar la autorrenovación y calcular la eficiencia de formación de esferas, lo que permite la comparación entre diferentes densidades de siembra.

Generación de mamósferas primarias: una técnica para determinar la potencia celular

Un método para procesar humano material de descarte mamaria quirúrgica se describe. Tejido procesado, en forma de organoides, se pueden almacenar indefinidamente congelados o ponen en cultivo para crecimiento a largo plazo. Este método permite el examen experimental de la normalidad biología celular epitelial humana, y los efectos de las perturbaciones exógenas.

Procesamiento de mamoplastia de reducción y tejidos humanos Mastectomía para el cultivo celular

Imagen de lapso de tiempo se utiliza para evaluar el comportamiento de las células mamarias preneoplásicas primarias epiteliales derivadas de los modelos de ratón genéticamente modificadas de riesgo de cáncer de mama para determinar si existen correlaciones entre los parámetros de comportamiento específicas y distintas lesiones genéticas.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Cultivo de células primarias de tejido intacto utilizando organoides proporciona un sistema modelo que imita el microambiente multi-celular in vivo. Desarrollamos un modelo de cultivo libre de suero primaria tejido epitelio de mama que perpetúa los linajes de cultivo de células mixtas y exposiciones morfología diferenciados, sin interrupción tejido enzimática. Organoides mamarios permanecen viables durante&gt; 6 meses.

No enzimática, libre de suero Cultivo de Tejidos de lesiones de mama pre-invasivas para la generación espontánea de mammospheres

Los ensayos de esferas in vitro se utilizan comúnmente para identificar células madre cancerosas. Aquí comparamos ensayos de esferas individuales con ensayos basados en múltiples células. Los ensayos más laboriosos basados en células individuales o la suplementación con metilcelulosa dan resultados más precisos, mientras que los ensayos basados en células múltiples realizados en medio líquido pueden verse muy influenciados por la densidad celular.

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos

Los ensayos de mama flotante pueden investigar el subconjunto de células de cáncer de mama similares a las células madre que sobreviven en condiciones de suspensión y muestran una tumorigénesis mejorada cuando se implantan en ratones.  Este protocolo proporciona una medida in vitro conveniente de la capacidad de formación de esferas, un indicador de la tumorigénesis in vivo, al tiempo que facilita el análisis del panorama transcripcional asociado al tallo.

Mammosphere Ensayo Formación de cáncer de mama humano tejidos y líneas celulares

El objetivo de esta metodología es identificar células madre cancerosas (CSC) en líneas celulares cancerosas y muestras de tumores humanos primarios con el protocolo de formación de esferas, de manera robusta, utilizando ensayos funcionales y caracterización fenotípica con citometría de flujo y occidental Blot.

Obtención de esferas de células madre de cáncer de cáncer de tumores ginecológicos y de cáncer de mama

Aquí, describimos la implementación e interpretación de los resultados de un ensayo cuantitativo de autorenovación de la mamismo in vitro.

Cuantificación de la auto-renovación en las culturas de la maméfera de la muriña

Este protocolo proporciona herramientas experimentales in vitro para evaluar la transformación de las células mamarias humanas. Se describen los pasos detallados para el seguimiento de la tasa de proliferación celular, la capacidad de crecimiento independiente del anclaje y la distribución de linajes celulares en cultivos 3D con matriz de membrana de sótano.

Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas

Este protocolo experimental describe el aislamiento de BCSC a partir de muestras de células y tejidos de cáncer de mama, así como los ensayos in vitro e in vivo que se pueden utilizar para evaluar el fenotipo y la función de BCSC.

Aislamiento y evaluación funcional de células madre de cáncer de mama humano a partir de muestras de células y tejidos

Este protocolo describe un enfoque escalable de cribado intraductal CRISPR que permite estudios paralelos in vivo de eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón.

Cribado in vivo paralelo de la eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón

Aprende a evaluar propiedades de células madre cancerosas en células epiteliales mamarias no tumorígenas mediante el ensayo de mamosferas con sobreexpresión de Api5. Este protocolo permite cuantificar la formación de mamosferas y la capacidad de autorrenovación in vitro.

El ensayo de mamosera revela el tallo inducido por Api5 en líneas celulares epiteliales mamarias no tumorígenas

Explorar más videos