Perfilado fenotípico de fenotipos conductuales tipo parkinsoniano inducidos por MPTP en larvas de pez cebra basado en un experimento conductual

Presentamos un protocolo de comportamiento multiparamétrico para perfilar de forma exhaustiva los fenotipos motores y no motores parkinsonquianos en larvas de pez cebra. Este protocolo se aplica a la modelización de la enfermedad de Parkinson, el cribado de fármacos, la neurotoxicidad ambiental y estudios con larvas de peces. Para empezar, lleva el equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, bata de laboratorio y gafas de protección.

Diluye una solución de 100x E3 en una proporción de uno a 100 con agua ultrapura para preparar un medio de concentración única. Ahora selecciona peces cebra adultos machos y hembras sexualmente maduros. Utilizando acuarios de cría con divisores removibles, realiza una reproducción controlada.

A las 20:00, coloca a los peces cebra macho y hembra en secciones separadas de los acuarios de cría en una proporción de dos machos por tres hembras, utilizando separadores para mantenerlos separados. A la mañana siguiente, a las 8:00, retira los separadores para permitir el apareamiento. Recoge los embriones una hora después y lávalos tres veces con agua limpia del sistema.

Alojar los embriones en placas de Petri de 100 milímetros que contienen 20 mililitros de medio fresco E3. Luego incubar los embriones a 28 grados Celsius bajo un ciclo de luz de 14 horas y un ciclo de oscuridad de 10 horas. Un día después de la fecundación, retirar cuidadosamente embriones no fecundados, malformados y anormales usando una pipeta de pasto.

Aspira el medio lentamente desde el borde de la placa de Petri y añade un medio embrionario fresco de E3 a lo largo de la pared de la placa de Petri para minimizar la perturbación en los embriones de tipo salvaje. Para el grupo tratado con MPTP, utilice una solución de MPTP de 50 micromolares. Cuatro días después de la fertilización, modifica una pipeta de pasto de tres mililitros cortando 10 milímetros de la punta para crear un tubo ancho.

A las 18:00, utilice la pipeta modificada para seleccionar las larvas de pez cebra de cada grupo y transfiera una larva por pozo a una placa de 96 pozos. Observa cada pozo bajo un microscopio estereoscópico para confirmar que cada larva de pez cebra parece estar sana. Verifica que las aletas estén abiertas y se balanceen regularmente, que el cuerpo esté erguido y que la escalera de natación esté inflada.

A continuación, limpia cuidadosamente la parte inferior de la placa para evitar que la suciedad afecte a los resultados del seguimiento de vídeo. Luego transfiere la placa de 96 pozos centralmente al fondo de la cámara de la caja cebra. Selecciona el modo de cuantización en el software de seguimiento de vídeo.

Para monitorizar la regulación del sueño y la vigilia, configura el ajuste de luz para apagar la luz a las 22:00 y encendela a las 8:00. Configura los parámetros del software para que el umbral de detección esté en 40, ráfaga en 25, congelación en cuatro, tiempo total de monitorización en 52 horas y luego tamaño en 60 segundos. Comienza el procedimiento de vigilia al sueño a las 8:00 PM.To monitoriza las respuestas fotomotoras, coloca las larvas cinco días después de la fertilización en una placa de 96 pozos con una larva por pozo. Luego configura el programa de transición de luz de cero a 60 segundos de oscuridad, seguido de 60 a 120 segundos de luz constante.

Inicia el protocolo y recoge los parámetros de movimiento cada seis segundos durante los 120 segundos del ensayo. Detén el protocolo a los 120 segundos y exporta el archivo de datos. Luego coloca las larvas en completa oscuridad durante cinco minutos para aclimatarlas al posterior análisis de luz estroboscópica oscura.

Configura el programa de transición de luz para entregar luz estroboscópica a 10 hercios durante 60 segundos. Para evaluar la tigmotaxia, selecciona dos placas de seis pozos. Llena cada pozo con cuatro mililitros de medio E3.

Cinco días después de la fertilización, recolecta larvas de pez cebra del grupo tipo salvaje y del grupo tratado con MPTP y colócalas en seis placas de pozo separadas. Antes de la evaluación de la thigmotaxis, coloca las placas del pozo en la caja cebra durante 15 minutos para permitir la aclimatación. Luego se utiliza la función de área de dibujado para dibujar dos círculos concéntricos en cada pozo con el radio del círculo interior igual a la mitad del radio del pozo, y comienza la evaluación.

Para una evaluación locomotora, transfiera larvas de pez cebra de cinco días del grupo tipo salvaje y del grupo tratado con MPTP en dos placas separadas de 12 pozos. Tras una aclimatación de 15 minutos, selecciona el modo de análisis en línea de seguimiento y registra la actividad locomotora durante cinco minutos usando el sistema automatizado de seguimiento de vídeo. Para la prueba de respuesta al sobresalto, transfiere larvas de cinco días individualmente en dos placas de 12 pozos con una larva por pozo y dos mililitros de medio E3.

Coloca los platos en la caja de cebra durante un periodo de aclimatación ligera de cinco minutos. Inicia el software ZebraLab y activa el modo de análisis online de seguimiento. Abre la interfaz de disparo de luz, luego selecciona, utiliza uno de los tres métodos de disparo que aparecen a continuación y activa los estímulos mejorados.

Luego, establece el método de inicio para que la sesión esté comenzando. En el calendario de transición, define el ritmo de destellos oscuros. Pon el programa para que se active después de 21 segundos, luego configura la transición de uno a cinco milisegundos con un 100% de intensidad de luz.

Transición de dos a dos, 890 milisegundos con 100% de intensidad de luz. Transición de tres a cinco milisegundos con 0% de intensidad de luz, y transición de cuatro a 100 milisegundos con 0% de luz de intensidad. Marca la casilla para repetir la lista de transiciones y así asegurar parpadeos periódicos y luego inicia el protocolo.

Para el ensayo de desafío de oscuridad clara, transfiere las larvas de pez cebra en dos placas de 24 pozos con una larva por pozo y un mililitro de medio E3. Tras cinco minutos de aclimatación en la caja de cebra, activa el modo de análisis de seguimiento online. Luego configura el programa de luz para seis minutos de luz constante, seguidos de cuatro minutos de completa oscuridad.

En el décimo minuto, detén el registro de comportamiento y guarda los datos. Retira cuidadosamente la placa de la caja de cebra. Tras cada experimento conductual, rocía y limpia todas las superficies en contacto con el MPTP con una solución de hipoclorito de sodio recién preparada.

Recoge residuos líquidos y sólidos que contienen MPTP y etiquétalos claramente como residuos neurotóxicos peligrosos. Trata todos los materiales contaminados con una solución de hipoclorito de sodio recién preparada. Las larvas tratadas de pez cebra mostraron trazas de sueño y actividad de vigilia alteradas en comparación con el grupo tipo salvaje.

El tiempo total de sueño también aumentó significativamente en el grupo tratado. El número de dormidas disminuyó significativamente en el grupo tratado, mientras que la duración media de las noches de descanso aumentó. La actividad en vigilia y la actividad media se vieron significativamente afectadas en el grupo tratado.

Bajo luz constante, el índice de congelación del grupo tratado aumentó significativamente. También aumentó significativamente bajo la estimulación con luz estroboscópica a 10 hercios. Las curvas de respuesta fotomotora mostraron una reactividad reducida en el grupo tratado.

Los resultados de seguimiento indicaron una reducción del comportamiento locomotor y exploratorio en el grupo tratado. La natación total y la velocidad media de natación también se redujeron significativamente en el grupo tratado. La relación de tiempo de movimiento congelado fue significativamente mayor en el grupo tratado, pero la relación de tiempos de movimiento rápido fue significativamente menor.

Las transiciones alternas de luz y oscuridad produjeron picos de velocidad pronunciados en larvas de tipo salvaje. La distancia nadada tras la estimulación y la velocidad máxima tras la estimulación disminuyeron significativamente en el grupo tratado. La latencia al inicio de la velocidad máxima del movimiento también se retrasó significativamente en el grupo tratado.

El principal desafío es minimizar los determinantes internos teniendo en cuenta la variabilidad individual para asegurar un análisis de comportamiento preciso y reproducible en el nivel de pez cebra. El agrupamiento conductual y el perfilado fenómico pueden aplicarse para descubrir efectos neurotóxicos sutiles y obtener conocimientos magnéticos más profundos. Estudios futuros pueden aplicar esta plataforma al cribado de fármacos aprobados por riesgos y a la evaluación farmacológica en modelos de enfermedad de Parkinson del pez cebra.