Extracción de ácidos grasos de cadena corta de heces de ratón usando un método ácido-disolvente bifásico

Este protocolo permite la extracción de ácidos grasos de cadena corta o SCFAs de muestras de heces de ratón de baja entrada para análisis rutinarios basados en cromatografía de gases. Los SCFA, incluyendo acetato, propionato y butirato, son producidos por la microbiota intestinal mediante la fermentación de la fibra dietética. Se estudian mucho porque están asociados con fenotipos conductuales, metabólicos y fisiológicos.

Sin embargo, cuantificar los SCFA en muestras fecales sigue siendo un reto. Estos metabolitos son volátiles, a menudo presentes en niveles bajos, y se miden en matrices biológicas complejas. En los estudios con ratones, la cantidad de material fecal recogida de cada animal también suele ser limitada.

Los métodos estándar pueden requerir derivatización, volúmenes de muestra relativamente grandes o equipos especializados. Aquí, se presenta un flujo de trabajo de extracción con disolvente ácido en dos fases utilizando ácido clorhídrico diluido y acetato de etil para la extracción de SCFAs de muestras heces de ratón de baja entrada, en un formato compatible con el análisis rutinario de GC. Así que empezamos con nuestro diseño adecuado para continuar con el resto del protocolo.

A continuación tenemos nuestra caja de muestras con las heces congeladas correctamente etiquetadas. Después, ajustamos nuestra pipeta de 1000 microlitros a 255. Ahora tenemos nuestra dilución de HCl etiquetada.

Seguimos asignando HCl a cada una de nuestras muestras. Ahora, echamos etanol en el pozo de limpieza para las pinzas. Ahora, usamos el mismo etanol para crear nuestro baño para los morteros.

Ahora, cogemos nuestras muestras de heces y las ponemos en los frascos de la centrifugadora. Ahora, usamos nuestros morteros limpios para triturar cada muestra de heces dentro de sus respectivos frascos de centrífuga. Tomamos nuestras muestras y las aplicamos al vórtice durante al menos 10 segundos o hasta que estén completamente mezcladas.

Llevamos las muestras mixtas a nuestra centrífuga y las montamos. Asegúrate de equilibrar correctamente la centrífuga. Ajusta la centrífuga a 16.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Después de 10 minutos, saca tus muestras de la centrífuga. Reetiqueta los nuevos frascos de centrifugadora correspondientes a tus muestras. Ajusta tu pipeta de 200 microlitros a 120.

Retira cuidadosamente el sobrenadante, asegurándote de no tocar el perdigón. Transfiere el sobrenadante a tus nuevos viales respectivos. Puedes desechar la bola.

Añade una cantidad igual de acetato de etílico en tus nuevos frascos. Lleva estas muestras de vuelta a la centrífuga. Ajusta la centrífuga a 2.374 veces g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.

Después de 20 minutos, retira tus muestras. Reetiqueta los nuevos frascos de centrifugadora correspondientes a tus muestras. Vuelve a poner la pipeta en 120 microlitros.

Ten cuidado de no tocar la capa inferior, eliminando solo la capa superior. Transfiere el sobrenadante a nuevos viales correctamente etiquetados. Transfiere estas muestras a tu caja de muestras para almacenarlas hasta que se análisen más.

Por último, coloca una caja de muestras en un congelador a menos 80 grados Celsius. Las alicuotas extraídas de SCFA, de 120 microlitros cada una, se almacenaron a -80 grados Celsius antes de cuantificarse mediante cromatografía de gases. El análisis cuantitativo identificó ocho SCFAs, incluyendo los metabolitos clave: ácido acético, ácido propiónico y ácido butírico, como se muestra en la figura.

Para validar el aislamiento SCFA, se evaluaron los datos de cromatografía de gases mediante pruebas de recuperación y reproducibilidad. La recuperación se evaluó aumentando las muestras de control con concentraciones conocidas del estándar interno, mientras que la reproducibilidad se verificó mediante análisis repetidos dentro y a lo largo de varios días. En resumen, este protocolo proporciona un flujo de trabajo para la extracción de SCFA a partir de muestras fecales de ratón de baja entrada.

No requiere derivatización y es compatible con el análisis rutinario basado en GC. Este método puede soportar la medición de SCFA fecal en diversos modelos murinos.