Evaluación funcional de la barrera epitelial gingival del ratón utilizando trazadores fluorescentes
27 de febrero de 2026
El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque estandarizado para evaluar cuantitativamente la integridad de la barrera epitelial gingival murina mediante la aplicación tópica de dextranos marcados con fluorescencia de diferentes tamaños moleculares sobre la superficie gingival in vivo, seguido de imágenes ex vivo mediante un sistema de microscopía de fotón único.
Este es un protocolo estandarizado para evaluar cuantitativamente la integridad de la barrera epitelial gingiva. Este protocolo es útil para estudiar enfermedades por disfunción de barrera y probar fármacos restauradores de barreras en la encía. Para empezar, dividir a ratones machos salvajes tipo C57BL/6J en tres grupos: un grupo de control no tratado, un grupo de periodontitis inducida por ligadura y un grupo de periodontitis inducida por Porphyromonas gingivalis.
Selecciona trazadores fluorescentes con espectros no solapados, como dextrano marcado con FITC y rodamina B marcado con dextran. Para diluir los trazadores, mezcla un gramo por litro de FD40 y RD70 en gel de carboximetilcelulosa al 2%. Guarda la mezcla preparada en hielo.
Tras confirmar la profundidad anestésica mediante el reflejo de pellizco del dedo, utiliza un mordaza bucal para mantener abierta la cavidad oral del ratón anestesiado. Aplicar 50 microlitros de la mezcla trazadora preparada tópicamente en la superficie gingival labial de la región molar. Deja la mezcla en su sitio durante 30 minutos y vuelve a aplicarla si la tragas.
Tras 30 minutos de aplicación del trazador, coloca al ratón en posición supina sobre cartón y asegura las extremidades con cinta para inmovilizar al animal. A continuación, abre la cavidad oral del ratón sacrificado y aísla el maxilar. Retira suavemente los tejidos circundantes y enjuaga bien la muestra con PBS.
Coloca el maxilar aislado sobre un portaobjetos de cristal. Luego coloca plastilina a ambos lados para estabilizar y asegurar la capa de cubierta sobre la muestra. Coloca cuidadosamente el maxilar diseccionado sobre el soporte de muestras diseñado a medida para asegurar una colocación estable para la imagen.
Utilizando un microscopio vertical de fotón único equipado con un objetivo de inmersión en agua de 25X. Enfoca en la zona de soporte montada bajo el maxilar y adquiere imágenes. Selecciona la región de interés en la superficie bucal del segundo molar dentro del maxilar y comienza la imagen rápidamente.
Adquiere imágenes en pila Z con un tamaño de paso de un micrómetro, comenzando desde la superficie gingival hasta una profundidad de 100 a 200 micrómetros para la reconstrucción tridimensional. En el software, haz clic en archivo y selecciona nueva carpeta para crear una nueva carpeta para el conjunto de datos y asignar un nombre descriptivo. En la pestaña de adquisición, ajusta el formato XY a 512 por 512 con una resolución de 0,99 micrómetros por píxel.
Luego pon el factor de zoom en uno. A continuación, ajusta las longitudes de onda de excitación a 488 nanómetros y 561 nanómetros. Configura ventanas de emisión a 500 a 550 nanómetros y de 570 a 620 nanómetros respectivamente.
Para la serie Z e imagen tridimensional, selecciona el modo de adquisición ND. Ajusta el paso Z a un micrómetro y ajusta si es necesario. Tras configurar los parámetros, selecciona el modo en vivo para visualizar el área gingival en canales de fluorescencia individuales y fusionados.
Luego haz clic en ejecutar ahora para empezar la adquisición de la imagen. Para medir la permeabilidad, separa la intensidad de fluorescencia de FD40 y RD70 en diferentes canales. Fusiona las secciones del eje Z sin resta de fondo.
Luego utiliza el software ImageJ para cuantificar la intensidad de fluorescencia y así evaluar la permeabilidad de la barrera epitelial. Haz clic en archivo y selecciona abrir para abrir la imagen del maxilar en ImageJ. Luego pulsa imagen y cambia el tipo de imagen a formato de 8 bits para el análisis.
Haz clic en analizar, selecciona establecer medidas. Luego comprueba el área, la media y la densidad integrada, y haz clic en aceptar para confirmar. Luego selecciona el canal deseado y ajusta el umbral haciendo clic en imagen, eligiendo ajustar y seleccionando umbral.
Activa la opción de fondo oscuro para tener en cuenta los fondos negros. Haz clic en analizar y selecciona establecer medidas. Luego comprueba el valor gris medio y el límite hasta el umbral, y confirma haciendo clic en aceptar.
Utilizando la herramienta de selección a mano alzada, traza manualmente el contorno de la región de la señal fluorescente en el lado del tejido gingival. Haz clic en analizar y seleccionar medir para obtener valores de intensidad de fluorescencia donde la densidad integrada representa la intensidad de fluorescencia. Copia los resultados de las mediciones en una hoja de cálculo para cálculos y gráficos.
Calcula la intensidad media de fluorescencia del grupo de control en la hoja de cálculo. Divide el valor de intensidad de fluorescencia de cada grupo experimental entre el promedio del grupo de control para obtener la intensidad relativa de fluorescencia. En el grupo de control, ambos trazadores fluorescentes estaban en gran medida confinados a la superficie gingival.
En ambos grupos tratados con ligadura y Porphyromonas gingivalis, se observó una extravasación significativa tanto de FD40 como de RD70 en el epitelio gingival. El análisis semicuantitativo demostró un aumento significativo de la intensidad de fluorescencia tanto de FD40 como de RD70 en los grupos tratados con ligadura y Porphyromonas gingivalis. La imagen 3D reveló una distribución de fluorescencia de trazadores más extensa y difusa alrededor de la vasculatura gingival en la ligadura y los grupos tratados por Porphyromonas gingivalis en comparación con los controles.
Este protocolo cuantifica la permeabilidad e integridad de la barrera paracelular gingival del ratón. Este protocolo puede combinarse con micro-CT para el análisis de imágenes multimodales. Estudios posteriores pueden explorar fármacos reparadores de barreras y mecanismos moleculares en enfermedades orales.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
La barrera epitelial gingival actúa como una defensa primaria crítica en la inmunidad y la homeostasis bucal. Una barrera epitelial intacta previene eficazmente la penetración de sustancias nocivas desde el entorno oral, mientras que su alteración está estrechamente asociada con la patogénesis de afecciones como la periodontitis y el liquen plano oral. Aquí, establecimos un método basado en la aplicación tópica para evaluar la integridad de la barrera epitelial gingival en ratones. Primero, se aplicó tópicamente una mezcla de dextranos marcados con fluorescencia de diferentes pesos moleculares (40 o 70 kDa) en una solución al 2% de carboximetilcelulosa sódica sobre la superficie gingival labial de la región molar. Tras un periodo de incubación de 30 minutos, se diseccionó el maxilar y se fijó en un soporte personalizado para su inmediata obtención de imágenes mediante un sistema de microscopía de un solo fotón. Este enfoque permite la visualización y cuantificación de trazadores de diferentes tamaños a través de las capas epiteliales, proporcionando una lectura funcional de la integridad de la barrera epitelial gingival aplicable a estudios de inflamación oral, cicatrización de heridas y modelado de enfermedades.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología oral
- Inmunología
- Función de barrera epitelial
Antecedentes
- La barrera epitelial gingival es una defensa primordial crítica en la inmunidad y la homeostasis orales.
- Una barrera epitelial íntegra previene la penetración de sustancias nocivas provenientes del entorno oral.
- La alteración de la barrera epitelial gingival está asociada con la periodontitis y el liquen plano oral.
- La evaluación funcional de la integridad de la barrera es esencial para estudiar la inflamación oral, la cicatrización de heridas y la modelización de enfermedades.
Objetivo del estudio
- Establecer un método basado en la aplicación tópica para evaluar la integridad de la barrera epitelial gingival en ratones.
- Permitir la visualización y cuantificación de trazadores de diferentes pesos moleculares a través de las capas epiteliales.
- Proporcionar una lectura funcional de la integridad de la barrera aplicable a modelos de enfermedades orales.
Métodos Utilizados
- Aplicación tópica de dextranos marcados con fluorescencia (40 o 70 kDa) en carboximetilcelulosa sódica al 2 % sobre la superficie gingival labial.
- Período de incubación de 30 minutos para permitir la penetración del marcador.
- Diseción y fijación del maxilar en un soporte personalizado.
- Imagen mediante un sistema de microscopía de un solo fotón.
- Cuantificación de la penetración del marcador a través de las capas epiteliales para evaluar la integridad de la barrera.
Resultados principales
- El método permite la visualización y cuantificación de dextranos fluorescentes de diferentes tamaños a través de las capas epiteliales gingivales.
- La penetración del marcador proporciona una lectura funcional de la integridad de la barrera epitelial gingival.
- El enfoque es aplicable a estudios de inflamación oral, cicatrización de heridas y modelado de enfermedades.
- La alteración de la barrera puede detectarse mediante un aumento en la penetración del marcador.
Conclusiones
- El método basado en la aplicación tópica de dextranos fluorescentes permite la evaluación funcional de la integridad de la barrera epitelial gingival en ratones.
- Este enfoque proporciona una herramienta valiosa para estudiar la inmunidad oral, la disfunción de la barrera y las patologías relacionadas.
- El método es adecuado para aplicaciones en inflamación oral, cicatrización de heridas y modelado de enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La barrera epitelial gingival actúa como una defensa crítica en primera línea en la inmunidad oral, y su alteración está asociada con enfermedades orales inflamatorias como la periodontitis. Este método proporciona una lectura funcional y cuantitativa de la integridad de la barrera mediante la penetración de trazadores dependiente del tamaño, permitiendo la reducción de riesgos mecanicistas en modelos de enfermedades orales. Además, apoya la validación de dianas y el desarrollo de ensayos para terapias dirigidas a la inmunidad mucosal y la cicatrización de heridas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con la función de barrera epitelial en la inmunidad oral.
- Valor operativo: Proporciona una lectura cuantitativa y selectiva por tamaño de la permeabilidad para validar funcionalmente dianas implicadas en la regulación de la barrera.
- Valor predictivo: Apoya la triage preclínica al distinguir compuestos que preservan o restauran la integridad de la barrera frente a aquellos que exacerban la permeabilidad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona un ensayo funcional para evaluar la selectividad de barrera mediante dextranos fluorescentes de pesos moleculares definidos (40 o 70 kDa).
- Valor operativo: Permite la cuantificación estandarizada y reproducible de la penetración de trazadores a través de capas epiteliales para cribado de compuestos.
- Preparación del ensayo: Facilita el desarrollo de lecturas cuantitativas de alta confiabilidad para estudios de penetración y retención en mucosa oral.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta las evaluaciones de la función de barrera en fase de descubrimiento con modelos preclínicos de inflamación oral y cicatrización de heridas.
- Relevancia para la Enfermedad: Aplicable directamente a la modelización de la periodontitis y el liquen plano oral, en las que la alteración de la barrera es un mecanismo patógeno clave.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite el monitoreo longitudinal de la curación o reparación de la barrera en respuesta a intervenciones terapéuticas.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica, permitiendo la evaluación temprana de la función de la barrera mucosa antes de avanzar a estudios de eficacia y seguridad en modelos de enfermedades orales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la regulación de la barrera epitelial y la homeostasis inmunitaria en la cavidad oral.
- Desarrollo de Ensayos: Genera resultados cuantitativos basados en imágenes para la penetración de trazadores, que facilitan el análisis de las relaciones estructura-actividad.
- Análisis: Proporciona datos medibles de permeabilidad dependientes del tamaño, que permiten comparar condiciones experimentales y los efectos de compuestos.
- Investigación Traducional: Conecta la evaluación funcional de la barrera con la validación preclínica en modelos de lesión y reparación de la mucosa oral.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar agentes de administración y retención mucosal, así como moduladores de la barrera, en diversos programas de I+D oral.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad en los vínculos mecanicistas entre la función de barrera y la patología oral.
- Valor operativo: Proporciona un flujo de trabajo estandarizado y compatible con técnicas de imagen, con resultados cuantificables para equipos multidisciplinarios.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al permitir la detección temprana de compuestos que comprometen o restauran la integridad de la barrera gingival.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de terapéuticos orales basada en resultados funcionales de barrera.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejidos orales, preparación de trazadores fluorescentes e imagenología por microscopía de fotón único.
- Depende del acceso a sistemas de microscopía capaces de resolver la penetración del trazador a través de las capas epiteliales.
- Necesita la estandarización de la concentración del trazador, tiempo de incubación y fijación del tejido para obtener resultados reproducibles.
- La adaptación a modelos ex vivo u otras especies puede requerir la optimización del vehículo de administración y los parámetros de incubación.
- Las limitaciones prácticas incluyen la viabilidad del tejido tras la disección y la posible variabilidad en el acceso a la superficie gingival.
