Imagen de superresolución y gestión compartida: un protocolo para microscopía confocal con detección multiplex

Nuestra investigación se centra en desarrollar métodos accesibles de imagen de superresolución para visualizar estructuras subcelulares dinámicas, superando el límite de difracción de la microscopía convencional. El método de superresolución enfrenta la fototoxicidad, la complejidad de la operación y la preparación especializada. Este protocolo reduce estas barreras mediante la detección de multiplex basada en confocalidades.

Para empezar, enciende la unidad principal del microscopio, el módulo de lanzamiento láser, la fuente de luz LED y el ordenador de control. Lanza el software operativo del microscopio. Desde la interfaz principal, selecciona GFP y luego elige apagar la luz reflejada.

Ve al panel de Adquisiciones. Desde el menú desplegable de objetivos de objetivos, selecciona el objetivo correspondiente. Para la imagen de células vivas, entre 45 y 60 minutos antes, activa la cámara ambiental y el sistema activo de estabilización de enfoque.

Una vez estabilizado el sistema, verifica la estabilidad usando los sensores de la cámara. Aplica aceite de inmersión en la lente frontal del objetivo sin introducir burbujas. Coloca la muestra preparada en el escenario del microscopio.

Levántalo con cuidado hasta que la cubierta toque el aceite de inmersión. A continuación, abre el software de adquisición. Ve a la pestaña de Adquisición y selecciona crear un nuevo experimento.

Ahora, añade pistas de imagen para los fluoróforos utilizados. Para cada pista, fija el diámetro del orificio estenopeico confocal a una unidad de aire. Para optimizar la potencia del láser, selecciona el primer canal y cambia al modo de escaneo en directo.

Ajusta la potencia inicial del láser a un valor bajo y luego ajusta la ganancia del detector a un nivel moderado dentro de su rango lineal. Después de eso, aumenta gradualmente la potencia del láser hasta que las estructuras objetivo sean claramente visibles por encima del fondo en la imagen en vivo. Configura el tamaño del píxel usando el botón de muestreo Nyquist del software para calcularlo automáticamente.

Después, establece la hora de los píxeles. Ahora, selecciona el modo de escaneo secuencial entre pistas para minimizar la diafonía. Haz clic en Snap para obtener una sola imagen.

Guarda la imagen con los metadatos relevantes. Para ajustes consistentes entre secciones ópticas, confirma que todos los parámetros de imagen están configurados en un único plano focal óptimo antes de definir el pila Z. Abre la pestaña de Adquisición y selecciona el modo Z-stack.

Define el volumen de interés usando un escaneo en vivo a alta velocidad para centrarte primero en la estructura más baja de interés y luego haz clic en Definir Último o Abajo. Ajusta cuidadosamente el enfoque hacia arriba hasta la estructura de interés superior y haz clic en Configurar primero o arriba. El software mostrará entonces la profundidad total.

El tamaño de la pila Z se establece para cumplir el criterio de muestreo de Nyquist. Usa el botón Óptimo para calcularlo automáticamente. Tras configurar los parámetros de imagen para cada canal, aumenta ligeramente la potencia o ganancia del láser para señales débiles en comparación con una sola imagen bidimensional.

Comienza la adquisición para recoger toda la pila de imágenes. Para la visualización, utiliza el módulo de procesamiento nativo del microscopio. Genera proyecciones de máxima intensidad para ver todas las señales enfocadas en una sola imagen bidimensional.

Luego realiza renderizado volumétrico utilizando los algoritmos integrados del software para generar una representación tridimensional. Ajusta el brillo, la opacidad y la iluminación según sea necesario. Posteriormente, se generan secciones transversales ortogonales XZ e YZ para inspeccionar la extensión axial y el registro.

La imagen de fluorescencia multicolor de células fijas de COS-7 mostró que los núcleos, mitocondrias y microtúbulos estaban claramente marcados con una superposición mínima, confirmando un escaneo secuencial efectivo y una detección optimizada. La proyección de máxima intensidad integra señales en todas las secciones ópticas, destacando la distribución espacial de estructuras marcadas con fluorescencia. Una reconstrucción tridimensional proporciona una visión consciente de la profundidad de la arquitectura de la muestra.

Se comparan imágenes en lapso de tiempo de células vivas de Hep 3B con mitocondrias marcadas con EGFP entre diferentes modos. Los marcos confocales a través de puntos temporales muestran estructuras claras, pero una pérdida gradual de señal. Los fotogramas estándar de superresolución o SR muestran mayor resolución, pero un aumento del blanqueamiento fotográfico con el tiempo.

Las imágenes de superresolución rápida o SR-4Y mantienen una fluorescencia estable incluso en momentos posteriores. El gráfico de la intensidad media de fluorescencia de EGFP en 100 puntos de tiempo demuestra que el modo SR-4Y mantuvo la señal más estable. El rendimiento de imagen en celdas COS-7 fijas se comparó entre modos, y los modos de superresolución proporcionaron detalles estructurales más claros que los confocales.

La medición de la función de dispersión puntual usando perlas fluorescentes de 100 nanómetros mostró que Airyscan SR con posterior deconvolución articular mejoró tanto la resolución lateral como axial en comparación con Airyscan SR por sí solo. Este protocolo permite a los investigadores estudiar la morfología de orgánulos, la dinámica del citoesqueleto y la colocalización de moléculas tanto en células fijas como vivas a una resolución aproximada de 120 nanómetros. La consideración más crítica de este protocolo es la preparación meticulosa de la muestra utilizando vidrio de cubierta de alta calidad y teñido optimizado para garantizar la integridad de la señal en un procesamiento de superresolución.

Siguiendo este procedimiento, los investigadores pueden realizar análisis cuantitativo de imágenes, como medir la relación señal-ruido o la colocalización, utilizando un software dedicado como ImageJ.