Name: Aislamiento, cultivo y transfección transitoria de células T humanas primarias para generar células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprende a aislar, cultivar y transfectar células T humanas primarias mediante electroporación de ARNm para generar células CAR-T. Este protocolo permite evaluar rápidamente constructos de receptores de antígenos quiméricos.

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<ol><li>Bartelt, R. R., Cruz-Orcutt, N., Collins, M., Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T+cell+receptor-induced+proximal+signaling+and+downstream+functions+in+immortalized+and+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of T cell receptor-induced proximal signaling and downstream functions in immortalized and primary T cells.</a> PLoS One. 4 (5), e5430(2009).</li>
<li>Smeets, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+profiling+of+T+lymphocyte+signal+transduction+pathways%3B+Th1+and+Th2+genomic+fingerprints+are+defined+by+TCR+and+CD28-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway profiling of T lymphocyte signal transduction pathways; Th1 and Th2 genomic fingerprints are defined by TCR and CD28-mediated signaling.</a> BMC Immunol. 13 (12), (2012).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jurkat+T-cell+lines+exhibit+marked+genomic+instability+affecting+karyotype%2C+mutational+profile%2C+gene+expression%2C+immunophenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Jurkat T-cell lines exhibit marked genomic instability affecting karyotype, mutational profile, gene expression, immunophenotype and function.</a> Sci Rep. 15 (1), 22426(2025).</li>
<li>Dobersberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineering+strategy+to+target+activated+EGFR+with+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells.</a> Cell Rep Methods. 4 (4), 100728(2024).</li>
<li>Van Bruggen, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+cells+impair+mitochondrial+fitness+in+CD8%2B+T+cells+and+impede+CAR+T-cell+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy.</a> Blood. 134 (1), 44-58 (2019).</li>
<li>Hoffmann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+expansion+potential+of+naive+chimeric+antigen+receptor+T+cells+from+healthy+donors+and+untreated+chronic+lymphocytic+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differences in expansion potential of naive chimeric antigen receptor T cells from healthy donors and untreated chronic lymphocytic leukemia patients.</a> Front Immunol. 8 (1956), (2017).</li>
<li>Zhang, D. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+CAR-T+cell+functionality+in+a+patient-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner.</a> Nat Commun. 14 (1), 506(2023).</li>
<li>Li, Y., Kurlander, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-CD3+and+anti-CD28-coated+beads+with+soluble+anti-CD3+for+expanding+human+T+cells%3A+differing+impact+on+CD8+T+cell+phenotype+and+responsiveness+to+restimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation.</a> J Transl Med. 8 (104), (2010).</li>
<li>Xu, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+comparative+analysis+reveals+differential+impacts+of+various+cytokines+on+CART+cell+phenotype+and+function+ex+vivo+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Multiparameter comparative analysis reveals differential impacts of various cytokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo.</a> Oncotarget. 7 (50), 82354-82368 (2016).</li>
<li>Cornish, G. H., Sinclair, L. V., Cantrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-cell+growth+by+IL-2+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15.</a> Blood. 108 (2), 600-608 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Foster, J. B., Barrett, D. M., Kariko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+in+vitro-transcribed+mRNA+in+adoptive+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">The emerging role of in vitro-transcribed mRNA in adoptive T cell immunotherapy.</a> Mol Ther. 27 (4), 747-756 (2019).</li>
<li>Becker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+effectiveness+of+gammadelta+T+cells+by+mRNA+transfection+of+chimeric+antigen+receptors+or+bispecific+T+cell+engagers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Enhancing the effectiveness of gammadelta T cells by mRNA transfection of chimeric antigen receptors or bispecific T cell engagers.</a> Mol Ther Oncolytics. 29, 145-157 (2023).</li>
<li>Wiesinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-scale+production+of+CAR-T+cells+for+the+treatment+of+melanoma+patients+by+mRNA+transfection+of+a+CSPG4-specific+CAR+under+full+GMP+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Clinical-scale production of CAR-T cells for the treatment of melanoma patients by mRNA transfection of a CSPG4-specific CAR under full GMP compliance.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1198(2019).</li>
<li>Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+meets+mRNA+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology.</a> Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).</li>
<li>Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-based+therapeutics--developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 759-780 (2014).</li>
<li>Underwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activators+exhibit+distinct+downstream+effects+on+chimeric+antigen+receptor+T+cell+phenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohorizons%22%5BJournal%5D)">T cell activators exhibit distinct downstream effects on chimeric antigen receptor T cell phenotype and function.</a> Immunohorizons. 8 (6), 404-414 (2024).</li>
<li>Zajc, C. U., Teufl, M., Traxlmayr, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+stability+analysis+of+yeast+displayed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity and stability analysis of yeast displayed proteins.</a> Methods Mol Biol. 2491, 155-173 (2022).</li>
<li>Seigner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+mystery+of+the+FMC63-CD19+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Solving the mystery of the FMC63-CD19 affinity.</a> Sci Rep. 13 (1), 23024(2023).</li>
<li>Jalkanen, A. L., Coleman, S. J., Wilusz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+and+implications+of+mRNA+poly%28A%29+tail+size--does+this+protein+make+my+tail+look+big%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Determinants and implications of mRNA poly(A) tail size--does this protein make my tail look big.</a> Semin Cell Dev Biol. 34, 24-32 (2014).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+encoding+a+chimeric+antigen+receptor+is+critical+for+the+generation+of+a+robust+T-Cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA encoding a chimeric antigen receptor is critical for the generation of a robust T-Cell response.</a> Hum Gene Ther. 30 (2), 168-178 (2019).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-mRNA+for+transient+CAR+T+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimal chimeric antigen receptor (CAR)-mRNA for transient CAR T cell generation.</a> Int J Mol Sci. 26 (3), 965(2025).</li>
<li>Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+assays+to+measure+CAR+T-cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+approach+to+generate+transient+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+mRNA+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A nonviral approach to generate transient chimeric antigen receptor T cells using mRNA for cancer immunotherapy.</a> J Vis Exp. (216), e67548(2025).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+mRNA+CAR+T+cells+targeting+GD2+provide+dose-adjusted+efficacy+against+diffuse+midline+glioma+and+high+grade+glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Transient mRNA CAR T cells targeting GD2 provide dose-adjusted efficacy against diffuse midline glioma and high grade glioma models.</a> Neuro Oncol. 27 (10), 2684-2696 (2025).</li>
<li>Usheva, Z. I., Petersen, D. L., Barington, T., Mouritzen, P., Barnkob, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+cytotoxicity+assay+to+assess+chimeric+antigen+receptor+T+cells+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Droplet-based cytotoxicity assay to assess chimeric antigen receptor T cells at the single-cell level.</a> J Vis Exp. (217), e67657(2025).</li>
<li>Subham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+cytotoxicity+evaluation+of+Jurkat+expressing+chimeric+antigen+receptor+using+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro cytotoxicity evaluation of Jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging.</a> J Vis Exp. (200), e65560(2023).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+primary+human+and+mouse+T+lymphocytes+using+RNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation.</a> Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Clausen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+the+activation-associated+receptors+CD25+and+CD69+on+human+NK-cells+and+NK-like+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells.</a> Immunobiology. 207 (2), 85-93 (2003).</li>
<li>Poloni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation-induced+marker+assays+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell activation-induced marker assays in health and disease.</a> Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).</li>
<li>Rotta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+flow+cytometry+immunophenotyping+of+human+antigen-specific+T+cells+by+activation-induced+marker+and+Th1+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for flow cytometry immunophenotyping of human antigen-specific T cells by activation-induced marker and Th1 cytokine detection.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103343(2025).</li>
<li>Elsallab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+primary+malignancies+after+commercial+CAR+T-cell+therapy%3A+analysis+of+the+FDA+adverse+events+reporting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Second primary malignancies after commercial CAR T-cell therapy: analysis of the FDA adverse events reporting system.</a> Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).</li>
<li>Verdun, N., Marks, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+cancers+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Secondary cancers after chimeric antigen receptor T-cell therapy.</a> N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).</li>
<li>Krug, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+activity+of+MCSP-specific+chimeric+antigen+receptors+%28CARs%29+depend+on+the+scFv+antigen-binding+domain+and+the+protein+backbone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Stability and activity of MCSP-specific chimeric antigen receptors (CARs) depend on the scFv antigen-binding domain and the protein backbone.</a> Cancer Immunol Immunother. 64 (12), 1623-1635 (2015).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+outperform+electroporation+in+mRNA-based+CAR+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles outperform electroporation in mRNA-based CAR T cell engineering.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101139(2023).</li>
<li>Sauerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mRNA+as+a+universal+technology+platform+to+transfect+a+variety+of+primary+cells+with+antigens+and+functional+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mRNA as a universal technology platform to transfect a variety of primary cells with antigens and functional proteins.</a> Methods Mol Biol. 2786, 219-235 (2024).</li>
<li>Bimbo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-specific+non-viral+DNA+delivery+and+in+vivo+CAR-T+generation+using+targeted+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell-specific non-viral DNA delivery and in vivo CAR-T generation using targeted lipid nanoparticles.</a> J Immunother Cancer. 13 (7), (2025).</li>
<li>Hudecek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+non-viral%3A+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+breaks+on+through+to+the+clinical+side%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).</li>
<li>Prommersberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircles+for+CAR+T+cell+production+by+sleeping+beauty+transposition%3A+a+technological+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Minicircles for CAR T cell production by sleeping beauty transposition: a technological overview.</a> Methods Mol Biol. 2521, 25-39 (2022).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum Mol Genet. 20 (R1), R14-R20 (2011).</li>
<li>Soundara Rajan, T., Gugliandolo, A., Bramanti, P., Mazzon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-Transcribed+mRNA+chimeric+antigen+receptor+T+cell+%28IVT+mRNA+CAR+T%29+therapy+in+hematologic+and+solid+tumor+management%3A+A+preclinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro-Transcribed mRNA chimeric antigen receptor T cell (IVT mRNA CAR T) therapy in hematologic and solid tumor management: A preclinical update.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).</li>
<li>Granit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+activity+of+autologous+RNA+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+in+myasthenia+gravis+%28MG-001%29%3A+a+prospective%2C+multicentre%2C+open-label%2C+non-randomised+phase+1b%2F2a+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study.</a> Lancet Neurol. 22 (7), 578-590 (2023).</li>
<li>Dagher, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+efficacy+of+multi-targeting+mRNA-based+CAR+T+cell+therapy+in+resection+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Preclinical efficacy of multi-targeting mRNA-based CAR T cell therapy in resection models of glioblastoma.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 36 (3), 102676(2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes, High Performance</td><td>VWR</td><td>525-1164</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates, flat bottom, TC-treated</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD staining solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-568</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag DYKDDDDK Antibody, APC, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-119-584</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Clinical Flow Cytometry System</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Merck</td><td>A4503-10G</td><td>Para aislamiento por flujo gravitacional</td></tr><tr><td>CD134 (OX40) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-048</td><td>Conjugado: PE</td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-764</td><td>Conjugado: APC</td></tr><tr><td>CD154 (CD40L) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-142</td><td>Conjugado: PerCP-VIO 700</td></tr><tr><td>CD25 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-541</td><td>Conjugado: PE-Vio 770</td></tr><tr><td>CD3 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-352</td><td>Conjugado: PE-Vio 670</td></tr><tr><td>CD4 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-223</td><td>Conjugado: APC-Vio 770</td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>Para aislamiento por flujo gravitacional</td></tr><tr><td>CD45 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-775</td><td>Conjugado: VioBlue</td></tr><tr><td>CD45RA Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-270</td><td>Conjugado: Vio Bright V600</td></tr><tr><td>CD62L Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-499</td><td>Conjugado: Vio Bright R720</td></tr><tr><td>CD69 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-800</td><td>Conjugado: VioGreen</td></tr><tr><td>CD8 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-677</td><td>Conjugado: FITC</td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td>Para aislamiento por flujo gravitacional</td></tr><tr><td>Cellstar 96 Well Suspension Culture Plate, U-bottom</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650 185</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810&nbsp;R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator ICO150</td><td>Memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>CoolNat Ice Machine</td><td>Ziegra Eismaschinen GmbH</td><td>ZBE 30-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning CoolCell Freezer Container</td><td>Corning</td><td>CLS432000</td><td></td></tr><tr><td>Counting chamber, Bürker-Türk pattern, BLAUBRAND</td><td>Brand</td><td>719520</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure tubes, 2 mL, QuickSeal screw cap</td><td>Sarstedt</td><td>72,380</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX LX Flow Cytometer</td><td>Beckmann Coulter</td><td>C11185</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) Cell culture grade</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes with 4 mm gap size, yellow cap</td><td>VWR</td><td>732-1137</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 0.1&ndash;2.5 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 100&ndash;1000 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 2&ndash;20 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 20&ndash;200 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Merck</td><td>E6758-100G</td><td>Para aislamiento por flujo gravitacional</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>325098</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Value FBS</td><td>Gibco</td><td>A52567-01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375-10G</td><td>Para aislamiento por gradiente de densidad</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Sterile Graduated Transfer Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13469108</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>with PC Module and CE Module</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with tailing)</td><td>New England Biolabs</td><td>E2060S</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-15, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-955</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-7, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-367</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&nbsp;PIPETBOY acu 2 pipet aid</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0085685</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Para aislamiento por flujo gravitacional</td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, PS, V-bottom, clear, non-binding</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651901</td><td></td></tr><tr><td>Monarch RNA Cleanup Kit (50 &mu;g)</td><td>New England Biolabs</td><td>T2040S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch Spin PCR &amp; DNA Cleanup Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>T

aislamiento, cultivo y transfección transitoria de células t humanas primarias para generar células t del receptor de antígenos quiméricos (car)

Isolation, Cultivation, and Transient Transfection of Primary Human T Cells to Generate Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells

Activación y expansión de las células T humanas primarias Las células T primarias se descongelaron y activaron al día 0 con perlas CD3/28 o TransAct, se expandieron durante 23 días y se contaron cada 2-3 días (Figura 2A). En los días de conteo, las densidades celulares se ajustaron a 0,3-0,5 x 106 celdas/mL. En los días 0/2/5/9/14/20, se utilizaron células T para análisis citométrico de flujo para evaluar el fenotipo y expresión de marcadores de activación. En la primera semana tras la activación, las células T proliferaron y se expandieron rápidamente con ambos reactivos de activación (Figura 2B), con una expansión de pliegue ligeramente menor en los días siguientes para las células T activadas por TransAct (Figura 2C). Cabe destacar que la activación de células T también fue visible mediante análisis microscópicos, formándose grupos de células T alrededor de los reactivos de activación (Figura 2D).
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Activación y expansión de células T primarias utilizando dos reactivos de activación diferentes. (A) Representación esquemática de la línea temporal experimental. Las células se activaron con perlas CD3/28 o TransAct el día 0 y se cultivaron durante 23 días. Los puntos azules representan los días en que se contaron las células, los rojos los días en que se analizaron por citometría de flujo y los puntos morados indican los días en que se realizaron ambos análisis. (B) y (C) expansión de células T primarias durante (B) la primera semana o (C) dentro de los 16 días posteriores al cultivo. Los valores muestran la media ± desviación estándar de 4 (CD3/28 perlas) o 3 (TransAct) diferentes donantes sanos de células T sanas. (D) Imágenes microscópicas representativas de células T activadas con agrupamiento celular visible en los días 1 y 2 después de la activación. Las imágenes se tomaron con un microscopio invertido. La regla corresponde a 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
Tinción del fenotipo de células T y marcadores de activación Para el análisis citométrico de flujo, se aplicó la siguiente estrategia de gating (Figura 3): Se aplicó una primera compuerta (FSC-Altura vs. SSC-Altura) para eliminar residuos celulares y perlas, seguida de la compuerta para celdas individuales (FSC-Ancho vs. Área SSC). El porcentaje de celdas CD3+ debería situarse en el rango del 98-100%. Un sub-gating adicional proporcionó el porcentaje de células T CD4+ (auxiliares) y células T CD8+ (citotóxicas), que fueron posteriormente activadas para diferentes subconjuntos fenotípicos de células T usando los marcadores CD45RA y CD62L. Además, se analizaron las células T CD3+ para la expresión de marcadores de activación (CD25/CD69/CD134/CD137/CD154).
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Estrategia de gating para el análisis citométrico de flujo. Se muestran gráficos de puntos representativos de un donante de células T activadas con perlas CD3/28 en el día 5 (n = 4). Abreviaturas; TEMRA = celdas de memoria efectoras T reexpresando CD45RA; TSCM = células T de memoria similares a células madre; TEM = células T de memoria efectora; MTC = células T de memoria central. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
Tras la activación con las perlas CD3/28, el porcentaje de células T CD4+ en comparación con CD8+ disminuyó con el tiempo, con un 74,3% (± 7,4%) de células T CD4+ en el día 5, que disminuyó al 14,6% (± 3,4%) al día 20 después de la activación. Las células T CD8+ aumentaron del 20,7% (± 6,4%) en el día 5 al 82,4% (± 3,1%) en el día 20 (Figura 4A). Se detectaron tendencias similares tras la activación con TransAct, con porcentajes ligeramente menores de células T CD8+ en el día 20 (72,5% ± 0,7%). Por lo tanto, la expansión ligeramente más lenta de las células T observada tras la activación con TransAct correspondió a un porcentaje menor de CD8+ y un mayor porcentaje de células CD4+ durante el periodo de expansión. Las diferencias en la composición fenotípica de las células T fueron similares en ambos reactivos de activación (Figura 4B). Sin embargo, las frecuencias de las células de memoria efectoras T que reexpresan CD45RA (TEMRA) fueron en general más altas para las células CD8+ que para las CD4+ . De forma concurrente, las células T CD4+ mostraron porcentajes más altos de células T de memoria central (MTC) y células T de memoria similar a células madre (CMT) (Figura 4B).
CD134 fue el único marcador de activación que ya estaba regulado al alza tras la descongelación de células T, con un 37,6% (± 4,1%) de células CD134+ activadas con perlas CD3/28 y un 36,1% (±4,4%) de células CD134+ para células T activadas por TransAct (Figura 4C). En ambas estrategias de activación, CD25, CD69 y CD134 estaban fuertemente regulados al alza al día 2. Para las perlas CD3/28, la expresión CD69 y CD134 alcanzó su máximo en el día 2, mientras que CD25 alcanzó su pico en el día 5. Se observaron resultados similares para las células T activadas por TransAct. CD134 y CD154 solo se aumentaron el día 14 tanto para las perlas CD3/28 como para las células activadas por TransAct. En general, las tendencias observadas fueron muy similares entre los dos reactivos de activación. Sin embargo, la expresión de CD69 en el día 14 fue ligeramente superior en células T activadas por CD3/28 que en sus homólogos TransAct (97,1% ± 0,9% frente al 86,5% ± 5,1%). Esto corresponde a la alta tasa de expansión prolongada observada en las células activadas por perlas CD3/28. En resumen, el panel propuesto de marcadores de activación incluye marcadores que se regulan al alza tanto en los primeros como en los posteriores tras la activación, con sensibilidades variables entre los distintos marcadores de activación, pero en general, tendencias similares para ambos reactivos de activación.
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Análisis del fenotipo de células T y expresión de marcadores de activación con diferentes reactivos de activación durante un periodo de cultivo de 20 días. (A) Porcentajes de células T CD4+/CD8+ durante el cultivo tras la activación con cuentas CD3/28 (izquierda) o TransAct (derecha). (B) Diferenciación de células T tras la activación con perlas CD3/28 (dos paneles izquierdos) o TransAct (dos paneles derechos), cada uno para celdas CD4+ o CD8+. El fenotipo se evaluó utilizando los marcadores CD45RA y CD62L. TEMRA: CD45RA+ CD62L-, TEM: CD45RA- CD62L-, TCM: CD45RA-CD62L+, TSCM: CD45RA+ CD62L+. (C) Expresión de marcadores de activación tras la activación con perlas CD3/28 o TransAct y durante el periodo de expansión. Se muestran frecuencias [%] de la población parental de células T CD3+ (media ± desviación estándar de 4 [perlas CD3/28] o 3 [TransAct] diferentes donantes sanos de células T sanas). Abreviaturas; TEMRA = celdas de memoria efectoras T reexpresando CD45RA; TSCM = células T de memoria similares a células madre; TEM = células T de memoria efectora; MTC = células T de memoria central. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
Transfección transitoria de células T primarias y análisis de la expresión de CAR Las células T primarias fueron transfectadas con ARNm mediante electroporación al día 7 tras la activación con perlas CD3/28 o TransAct. Como plantilla, se utilizó ARNm codificando para un CAR de segunda generación dirigido al proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPG4) con un dominio coestimulador CD28 y un dominio de señalización CD3ζ. Se incluyó una etiqueta DYKDDDDK (etiqueta de bandera) para permitir la detección citométrica de flujo. La viabilidad de las células T y la expresión de CAR se evaluaron 3, 6, 24 y 48 horas después de la electroporación. La tinción se realizó según lo descrito en la sección 6 del protocolo.
Aunque la viabilidad tanto de las células T activadas por perlas CD3/28 como de las activadas por TransAct era baja 3 horas después de la electroporación, en general, la viabilidad de las células CAR T transfectadas oscilaba entre el 51 y el 85% y no difería significativamente entre ambas estrategias de activación (Figura 5A). El CAR ya era detectable en este punto temprano tras la electroporación. Aunque el porcentaje de células CAR+ disminuyó gradualmente con el tiempo, la frecuencia más alta de células CAR+ fue detectable en menos de 24 horas tras la electroporación (Figura 5B, panel izquierdo). Cabe destacar que la intensidad de la señal se mantuvo estable en las primeras 6 horas tras la electroporación y disminuyó gradualmente después (Figura 5B, panel derecho). La expresión de CAR estuvo casi ausente tras 48 horas, demostrando la naturaleza transitoria de la manipulación celular y la importancia de elegir una ventana temporal temprana para los ensayos posteriores. Los gráficos de puntos representativos para la expresión CAR de un donante se muestran en la Figura 5C. Para ambos reactivos de activación, la proporción CD4/CD8 no diferió entre células transfectadas por CAR y MOCK (Figura 5D). En consonancia con nuestros resultados previos, las células T activadas con perlas CD3/28 mostraron una frecuencia ligeramente mayor de células T CD8+ que las células activadas con TransAct. Para el análisis fenotípico, se muestra un donante representativo debido a grandes variaciones dependientes del donante (Figura 5E). Aunque tanto el reactivo activador como el estado CD4/CD8 influyen en el fenotipo de las células T, la expresión de CAR no provoca un cambio en el fenotipo en comparación con las células transfectadas por MOCK.
Para evaluar la influencia de la concentración de ARNm en los niveles de expresión, se transfeccionaron células T primarias con ARNm codificando una versión mutante de GFP (muGFP) utilizando 0,1, 0,3, 1, 3 o 6 μg de ARNm. La señal de GFP se midió mediante citometría de flujo 24 horas después de la electroporación. Como era de esperar, ya cantidades tan pequeñas de ARNm como 0,1 μg dieron lugar a una señal detectable de GFP, con un aumento gradual de la intensidad de la señal a medida que aumentaba la cantidad de ARNm. En nuestros experimentos, 1 μg de ARNm ya estaba saturado, y cantidades mayores (3 y 6 μg de ARNm) no provocaron un aumento de la señal de GFP (Figura 5F). Esto resalta la posibilidad de utilizar diferentes cantidades de ARNm para titular los niveles de expresión, lo que puede ser beneficioso para evaluar la influencia de diferentes niveles de expresión de antígenos CAR- o inclusoobjetivo 28.
<img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Cinética de expresión de CARs y análisis fenotípico de células CAR T transfectadas. (A) Viabilidad de las células T CAR tras la electroporación con ARNm codificador de CAR. Se utilizaron 2 μL de 7-AAD en 100 μL de tampón de tinción para evaluar la viabilidad tras 10 minutos de incubación. n = 2-3 donantes individuales (B) Tinción para expresión de CAR con un anticuerpo anti-DYKDDDDK (conjugado con APC, dilución final 1:50). Tras la gratificación de las células viables, se analizó el porcentaje de células CAR-positivas en relación con controles transfectados por MOCK (panel izquierdo) o la intensidad mediana geométrica de fluorescencia (GeoMedia, panel derecho) de toda la población. Se muestran promedios de n = 3 donantes individuales ± S.D. (C) Gráficos de puntos representativos de un donante de (B) que demuestran la cinética de la expresión de CAR a lo largo del tiempo. (D) Análisis de células T CD4+/CD8+ y comparación de células T transfectadas por MOCK con células T transfectadas por CAR, y dos estrategias de activación diferentes 24 horas después de la electroporación. Se muestran promedios de n = 3 donantes individuales ± S.D. (E) Análisis fenotípico de células T transfectadas por MOCK y CAR mostradas en (B) 24 horas después de la electroporación. Se muestra un donante representativo de n = 3. (F) Análisis de la expresión de muGFP 24 horas después de la electroporación con diferentes cantidades de ARNm. La compuerta para células vivas se realizó antes de que se cuantificara la GeoMédia para GFP. Se muestran promedios de n = 3 donantes ± abreviaturas S.D.; CAR = receptor de antígeno quimérico; ARNm = ácido ribonucleico mensajero; 7-AAD = 7-aminoactinomicina; RT = temperatura ambiente; muGFP = proteína fluorescente verde mutante; S.D. = desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>

Aislamiento, cultivo y transfección transitoria de células T humanas primarias para generar células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)

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Aislamiento, cultivo y transfección transitoria de células T humanas primarias para generar células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)

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