Flujo de trabajo de criotomografía electrónica para tejidos gruesos demostrado en hipocampo de ratón

Mi investigación se centra en establecer un flujo de trabajo estandarizado de crio-ET para permitir el análisis estructural in situ de tejidos gruesos como el hipocampo del ratón. Los métodos existentes carecen de fiabilidad para tejidos gruesos, por lo que este protocolo integra pasos optimizados para un análisis estandarizado. Para empezar, coloca una gota de 10 L de solución de sacarosa al 10% sobre una superficie de cristal limpia.

Disecciona rápidamente el hipocampo de un ratón recién eutanasiado. Con una cuchilla afilada, extirpe pequeños trozos de tejido de 0,5 a 1 milímetro cúbico. Utilizando un palillo o cepillo fino, transfiere el tejido a las rejillas TEM de soporte de cobre preparadas dentro del portador de congelación a alta presión.

Utiliza 2-metilpentano para mantener el tejido húmedo y ajusta su posición en la rejilla, minimizando el esfuerzo mecánico para evitar daños en la rejilla. Luego, cubre el tejido y la rejilla con un disco de lámina de cobre de 3 milímetros de diámetro. Para completar el conjunto, coloca el segundo portador de congelación a alta presión, con el lado plano hacia abajo, encima para formar un sándwich de gofre sellado.

Y comprueba los parámetros de congelación para asegurarte de que no hay ninguna anomalía en el instrumento. Asegúrese de que el tiempo total desde la disección del tejido hasta la congelación no supere los 90 segundos. Obtener una nueva rejilla dorada de 300 mallas para servir como rejilla receptora final para el procedimiento de levantamiento.

Bajo un microscopio estereoscópico a temperatura ambiente, agrafa suavemente la rejilla a un anillo AutoGrid criofílico compatible. Luego, guarda el AutoGrid ensamblado directamente en un horno seco, mantenido a aproximadamente 40 grados Celsius, para minimizar la acumulación de escarcha antes de su uso. Mientras sumerges continuamente el conjunto en nitrógeno líquido, separa cuidadosamente la rejilla TEM vitrificada de los componentes circundantes del conjunto de gofres.

Usando pinzas de punta fina preenfriadas, separe suavemente los dos portadores de congelación a alta presión. A continuación, en una estación de trabajo de carga criogenial preenfriada, montar la rejilla de tejido aislado en un segundo anillo AutoGrid criofí-FIB bajo la protección de nitrógeno líquido. Carga ambas AutoGrids en las ranuras designadas del portamuestras del transbordador criotransferente.

Orienta cada AutoGrid de modo que la muesca de fresado mire hacia fuera y se posicione verticalmente para permitir un ángulo de fresado más bajo. Mantén el transbordador completamente cargado sumergido en nitrógeno líquido o en estado pre-refrigerado hasta la transferencia al FIB-SEM. Carga la etapa de muestra en el instrumento usando la varilla de muestra.

Tras la criotransferencia al microscopio, se desplaza hasta la rejilla de tejido con bajo aumento SEM. Luego, aplica un recubrimiento de pulverización sobre la superficie de la rejilla con platino a 30 miliamperios durante 15 segundos para proporcionar protección conductiva. Deposita una cápsula organometálica de platino de 0,5 a 1,0 micrómetros de grosor utilizando el sistema de inyección de gas durante aproximadamente 60 segundos.

Aplica una capa final de platino recubierta por pulverización sobre la superficie de la rejilla a 30 miliamperios durante 15 segundos. Usando la imagen del haz de electrones SEM, navega hasta la región seleccionada de interés en la rejilla de tejido. Para orientar la muestra para fresado frontal, ajusta la etapa a aproximadamente 110 grados de rotación y 7 grados de inclinación para presentar la superficie de la muestra en un ángulo adecuado para el acceso al haz iónico.

Para el fresado de zanjas, se define una zanja rectangular que rodea el bloque de tejido objetivo usando el haz de iones operado a 30 kilovoltios. Comienza a fresar a distancia del bloque usando una corriente relativamente alta de 15 nanoamperios para lograr una rápida eliminación del material. A medida que las paredes de la zanja se acercan al bloque con una precisión de pocos micrómetros, se reduce la corriente del haz iónico a 7 nanoamperios para lograr un control de fresado más preciso.

Deja un lado del bloque unido al material a granel para crear una pestaña temporal de sujeción. Para bloques de tejido con un espesor estimado superior a 20 micrómetros, realiza un paso de fresado por debajo del lado contrario para facilitar el levantamiento final. Gira el escenario y ajusta la inclinación para acceder a la parte inferior del bloque.

Fresa la conexión inferior usando el haz de iones enfocados a 30 kilovoltios y una corriente de 3 nanoamperios. Fresa la parte inferior del bloque metálico para que encaje firmemente contra el bloque de muestra. Fresa con precisión la superficie de contacto entre la muestra y el bloque de oro para que el contacto sea más ajustado.

Para unir la muestra a la aguja, asegúrate de que el bloque de oro esté en contacto directo con la muestra objetivo. Utilizando el haz de iones focalizados a 30 kilovoltios y 0,5 nanoamperios, realiza de 8 a 12 patrones de fresado secuenciales en sección transversal en la interfaz para soldar el bloque de oro a la muestra. Para extraer el bloque de tejido, corta la lengüeta restante que conecta el bloque con la muestra a granel usando el haz de iones enfocado.

Maniobra cuidadosamente la aguja micromanipuladora para levantar el bloque de tejido aislado completamente fuera de la zanja y la rejilla circundante. Retrae la aguja y transporta el bloque a la rejilla del receptor. Navega la aguja del micromanipulador hasta una rejilla de receptores dorados de 300 mallas preenfriada.

Baja el bloque sobre una casilla de cuadrícula elegida. Elimina pequeños cristales de hielo en la rejilla para que el bloque y la rejilla de tejido se adhieran más firmemente. Baja el bloque de tejido para que toque solo la rejilla.

Fresa una rebanada de 3 a 4 micrómetros de grosor desde el bloque sobre la película de la rejilla usando el haz iónico. A continuación, suelda la rebanada de forma segura fresándose, utilizando patrones de sección transversal limpia a ambos lados de la unión, y vuelve a aplicar el recubrimiento conductor y protector a la superficie de la rejilla como se ha demostrado anteriormente. Para el adelgazamiento de lamelas, tras ajustar la inclinación del escenario, se define la posición final de la lámina dentro de una zona lisa del bloque tisular.

Realizar fresado sistemático utilizando corrientes de haz de iones y compensaciones de sobreinclinación especificadas en la tabla presentada. Cuando se encuentre a menos de 1 a 2 micrómetros de la lámina, opcionalmente fresa una zanja de alivio de tensión a aproximadamente 1,5 micrómetros para evitar que la lámina se doble o se enrolle. Tras la preparación de la lamela, adquiere imágenes mediante criomicroscopía electrónica.

Los bloques de tejido procesados mediante congelación a alta presión con el método waffle exhibían una apariencia uniforme y transparente para los electrones. Tomografías reconstruidas resolvieron las estructuras mitocondriales dentro del entorno celular. Los complejos macromoleculares, como los ribosomas, se resolvieron claramente en el citoplasma.

También se observaron características celulares del citoesqueleto y de membrana, así como complejos porosos nucleares, en los tomografías reconstruidos. Las estructuras y características sinápticas, incluyendo reservas de calcio y estructuras de vaina de mielina, se observaban claramente en los tomografías. Este protocolo permite a los investigadores estudiar la estructura celular externa nativa directamente dentro de entornos tisulares complejos.

El desafío más crítico en este protocolo crio-ET es lograr una vitrificación uniforme y libre de artefactos de muestras de tejido grueso. Siguiendo este procedimiento, los investigadores pueden localizar regiones de interés utilizando microscopía correlativa de luz y electrónica o técnicas de marcado, y luego realizar promediados subtomográficos y análisis estructurales para resolver complejos macromoleculares.