Secuenciación y ensamblaje de plásmidos de lectura larga utilizando flujos de trabajo basados en secuenciación nanopore

Investigamos la replicación, mantenimiento y difusión de elementos circulares de ADN autorreplicantes, conocidos como plásmidos, lo que requiere la determinación de sus secuencias. Este protocolo aborda los problemas de cobertura y precisión asociados con la secuenciación de lectura larga enriqueciendo el ADN plasmídico y optimizando los métodos de ensamblaje. Nuestro protocolo está diseñado para secuenciar plásmidos en situaciones donde la secuencia cromosómica es conocida o irrelevante.

Para empezar, estrías las muestras sobre placas de barrena LB suplementadas con el antibiótico adecuado para seleccionar el marcador de resistencia transmitido por plásmidos correspondiente. Incuba las placas a 37 grados Celsius durante 24 horas. Al día siguiente, inocular entre tres y cinco mililitros de medio LB suplementado con el antibiótico adecuado con una sola colonia aislada.

Incubar el cultivo agitando a 37 grados Celsius durante aproximadamente ocho horas o hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance uno o dos. Luego inocular 400 mililitros de medio LB suplementado con el antibiótico adecuado con 400 microlitros del cultivo inicial e incubar como se demostró anteriormente. Luego transfiere el cultivo a botellas centrífugas apropiadas al volumen de cultivo.

Centrifugar a 4,200 G durante 10 minutos y volver a suspender el pellet usando los volúmenes de reactivos recomendados por el fabricante. Tras la lisis y neutralización celular, centrifugar el lisado a 4.200 G durante 30 minutos. Transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo y centrifugarlo de nuevo.

Realiza equilibrio, lavado y elución de ADN según las instrucciones del fabricante. Luego se resuspende el ADN precipitado en 100 microlitros de agua libre de nucleasas para maximizar la concentración y preparar la biblioteca de nanoporos. A continuación, para cuantificar el ADN, prepara los tubos de ensayo según la tabla presentada.

Tras calibrar el fluorómetro, inserta los tubos de muestra en el fluorómetro y registra las lecturas según el manual de instrumentos. Programa el ciclador térmico a 30 grados Celsius durante dos minutos, seguido de 80 grados Celsius durante dos minutos. Centrifuga y mezcla los componentes descongelados del kit según la tabla presentada.

Incubar los tubos de PCR preparados para codificación de barras usando el programa de ciclador térmico. Luego coloca los tubos sobre hielo para que se enfríen. Agrupa las muestras con código de barras en un tubo limpio de Eppendorf de 1,5 mililitros, asegurando que el volumen total no supere los 1.000 microlitros.

Una vez que las cuentas están en vórtice, añade un volumen igual de cuentas a las muestras agrupadas con código de barras. Mezcla haciendo un chasquido del tubo, seguido de una incubación de 10 minutos. Luego lava las esferas con un mililitro de etanol al 80% mientras estás sobre el imán.

Retira el etanol y repite una vez. Quita el tubo del imán. Suspende las perlas en el buffer de elución usando el volumen adecuado según el número de códigos de barras en uso e incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Cuantifique la concentración de ADN utilizando un microlitro de la muestra eludida en el fluorómetro para confirmar la preparación exitosa de la biblioteca. Para la ligación del adaptador, transfiere 11 microlitros de la biblioteca de ADN a un nuevo tubo y etiquetelo. Luego mezcla los componentes presentados en un tubo nuevo para diluir el adaptador rápido descongelado.

A continuación, añade un microlitro de adaptador rápido diluido a los 11 microlitros de la biblioteca de ADN y gira el tubo para mezclar el contenido. Centrifuga brevemente el tubo para asegurarte de que el volumen completo se acumula en el fondo e incuba el tubo en el banco durante cinco minutos. Prepara la mezcla de cebado de celda de flujo en un tubo de ADN fresco y mezcla por inversión y pipeteo.

Levanta la tapa del dispositivo e inserta la celda de flujo en ella mientras aplicas una presión suave para asegurar la colocación correcta. Después de comprobar si hay burbujas de aire dentro o junto al puerto de cebado, retira entre 20 y 30 microlitros de fluido para eliminar las burbujas. Luego extrae 800 microlitros de mezcla de cebado y despláchalos en el puerto de cebado evitando burbujas de aire y deja reposar el dispositivo durante cinco minutos.

Mezcla la biblioteca de ADN con el volumen adecuado de cuentas de biblioteca en un tubo nuevo, como se presenta aquí. Carga 200 microlitros de mezcla de cebado en el puerto de cebado de la celda de flujo. Ajusta la tapa del puerto de muestra para revelar el puerto.

Dispensa 75 microlitros de la biblioteca de ADN con perlas en el puerto de muestra, una gota a la vez, permitiendo que cada gota se absorba antes de añadir la siguiente. Luego vuelve a aplicar la tapa del puerto de muestra y cierra el puerto de cebado. Una vez cerrada la tapa del dispositivo, comienza la secuenciación.

Establezca el límite de tiempo de ejecución basado en el número de plásmidos multiplexados con un valor por defecto de 48 horas y un máximo de 72 horas. Selecciona el modo de llamada de base súper preciso y la opción adecuada de kit de código de barras rápido. Luego selecciona los datos en bruto de FAST5 o POD5 y comienza a llamar a la base.

Para generar un archivo FASTQ filtrado para ensamblaje posterior, recortar lecturas largas usando Filtlong para eliminar aproximadamente entre el 5 y el 10% de las lecturas de menor calidad mientras se conserva aproximadamente el 90% del rendimiento total. La submuestra se lee usando Autocycler según los ajustes recomendados. Ensambla cada subconjunto de lectura usando Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler y otros ensambladores seleccionados.

Visualiza cada archivo de grafo de ensamblaje usando vendaje. Evalúa los contigs para circularidad, consistencia de tamaño entre ensambladores y evidencia de uniones quiméricas. Elimina contigs lineales que carecen de soporte entre varios ensambladores y conserva contigs circulares con estimaciones de tamaño consistentes.

Eliminar contigs menores sin soporte antes de la generación por consenso cuando los plásmidos principales están circularizados. Procede a la generación de consenso tras la curación manual. Genera la secuencia de consenso usando Autocycler con los ensamblajes seleccionados.

Ejecuta los comandos restantes del Autocycler para producir la secuencia final de plásmidos consensuados. Por último, pulir el ensamblaje final usando lecturas largas recortadas con Medaka para mejorar la precisión del consenso. Todos los ensayos de conjugación produjeron transconjugantes, confirmando la presencia de un plásmido conjugativo en los donantes.

Los tamaños de las secuencias de plásmidos ensamblados coincidieron con estimaciones basadas en la movilidad de electroforesis del gel de campo de pulso. La secuenciación nanopore produjo una salida de lectura y calidad suficientes para todas las muestras analizadas. Las tasas de contaminación cromosómica oscilaron entre el 72,1% y el 28,0%, con una media del 46,9%. El análisis de electroforesis en gel de campo pulso del plásmido de la cepa UPEC_271 reveló una banda correspondiente a un plásmido de aproximadamente 145 pares de kilobases.

El ADN de uno de los transconjugantes mostró una secuencia idéntica a las 145 kilobases. El análisis de electroforesis en gel de campo pulso de la sangre de la deformación 100913 identificó dos plásmidos de aproximadamente 70 y 110 pares de kilobases. La secuenciación por nanoporos confirmó dos conjuntos de plásmidos de 71.182 pares de bases y 111.226 pares de bases.

La consideración más importante es si la secuencia cromosómica es de interés. Si es así, los protocolos estándar de secuenciación del genoma completo son mejores. La mayor cobertura de nuestro protocolo abre la puerta al estudio de la heteroplasmia, es decir,

variación de la secuencia plasmidiana dentro de una población dada.