Secuenciación y ensamblaje de plásmidos de lectura larga utilizando flujos de trabajo basados en secuenciación nanopore

Investigamos la replicación, mantenimiento y diseminación de elementos de ADN circular autorreplicantes, conocidos como plásmidos, lo que requiere la determinación de sus secuencias. Este protocolo aborda problemas de cobertura y precisión asociados con la secuenciación de lecturas largas mediante la enriquecimiento de ADN plasmídico y la optimización de los métodos de ensamblaje. Nuestro protocolo está diseñado para secuenciar plásmidos en situaciones donde la secuencia cromosómica es conocida o irrelevante.

Para comenzar, extienda las muestras en placas de LB auger suplementadas con el antibiótico apropiado para seleccionar el marcador de resistencia portado por el plásmido respectivo. Incubar las placas a 37 grados Celsius durante 24 horas. Al día siguiente, inocule de tres a cinco mililitros de medio LB suplementado con el antibiótico apropiado con una colonia aislada única.

Incúbela la cultura con agitación a 37 grados Celsius durante aproximadamente ocho horas o hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance uno a dos. Luego inocule 400 mililitros de medio LB suplementado con el antibiótico apropiado con 400 microlitros de la cultura iniciadora e incúbela como se demostró anteriormente. Luego transfiera la cultura a botellas de centrífuga apropiadas para el volumen de la cultura.

Centrífugala a 4.200 G durante 10 minutos y resuspenda el sedimento usando los volúmenes de reactivo recomendados por el fabricante. Después de la lisis celular y la neutralización, centrifugue el lisado a 4.200 G durante 30 minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y centrífugalo nuevamente.

Realice la equilibración, el lavado y la elución del ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, resuspenda el ADN precipitado en 100 microlitros de agua libre de nucleasas para maximizar la concentración para la preparación de la biblioteca nanopore. A continuación, para cuantificar el ADN, prepare los tubos de ensayo según la tabla presentada.

Después de calibrar el fluorómetro, inserte los tubos de muestra en el fluorómetro y registre las lecturas de acuerdo con el manual del instrumento. Programe el ciclotérmico a 30 grados Celsius durante dos minutos, seguido de 80 grados Celsius durante dos minutos. Gire y mezcle los componentes del kit descongelados según la tabla presentada.

Incúbela los tubos de PCR preparados para el código de barras utilizando el programa del ciclotérmico. Luego coloque los tubos sobre hielo para enfriarlos. Agrupe las muestras codificadas por color en un tubo Eppendorf limpio de 1,5 mililitros, asegurándose de que el volumen total no exceda 1.000 microlitros.

Una vez que las perlas estén agitadas, agregue un volumen igual de perlas a las muestras codificadas por color agrupadas. Mezcle agitando el tubo, seguido de una incubación de 10 minutos. Luego lave las perlas con un mililitro de 80%de etanol mientras están en el imán.

Retire el etanol y repita una vez. Retire el tubo del imán. Resuspenda las perlas en tampón de elución usando el volumen apropiado según el número de códigos de barras en uso e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Cuantifique la concentración de ADN usando un microlitro de la muestra eluida en el fluorómetro para confirmar la preparación exitosa de la biblioteca. Para la ligación del adaptador, transfiera 11 microlitros de la biblioteca de ADN a un tubo nuevo y etiquételo. Luego mezcle los componentes presentados en un tubo fresco para diluir el adaptador rápido descongelado.

A continuación, agregue un microlitro de adaptador rápido diluido a los 11 microlitros de biblioteca de ADN y agite el tubo para mezclar el contenido. Gire el tubo brevemente para asegurar que el volumen completo se recolecte en la parte inferior e incube el tubo en el banco durante cinco minutos. Prepare la mezcla de cebado del celo de flujo en un tubo de ADN fresco y mezcle por inversión y pipeteo.

Levante la tapa del dispositivo e inserte el celo de flujo en él aplicando una presión suave para asegurar una colocación adecuada. Después de verificar la presencia de burbujas de aire dentro o adyacentes al puerto de cebado, retroceda 20 a 30 microlitros de fluido para eliminar las burbujas. Luego aspire 800 microlitros de mezcla de cebado y dispénsela en el puerto de cebado evitando burbujas de aire y deje que el dispositivo repose durante cinco minutos.

Mezcle la biblioteca de ADN con el volumen apropiado de perlas de biblioteca en un tubo nuevo como se presenta aquí. Cargue 200 microlitros de mezcla de cebado en el puerto de cebado del celo de flujo. Ajuste la cubierta del puerto de muestra para revelar el puerto.

Dispense 75 microlitros de la biblioteca de ADN con perlas en el puerto de muestra una gota a la vez, permitiendo que cada gota se absorba antes de agregar la siguiente. Luego vuelva a colocar la cubierta del puerto de muestra y cierre el puerto de cebado. Una vez que se cierre la tapa del dispositivo, comience la ejecución de la secuenciación.

Establezca el límite de tiempo de ejecución basado en el número de plásmidos que se están multiplexando con un valor predeterminado de 48 horas y un máximo de 72 horas. Seleccione el modo de llamada de bases súper preciso y la opción de kit de código de barras rápido apropiada. Luego seleccione los datos FAST5 o POD5 sin procesar y comience la llamada de bases.

Para generar un archivo FASTQ filtrado para el ensamblaje posterior, recorte las lecturas largas usando Filtlong para eliminar aproximadamente el 5-10%de las lecturas de menor calidad mientras se retiene aproximadamente el 90%del rendimiento total. Submuestree las lecturas usando Autocycler de acuerdo con la configuración recomendada. Ensamble cada subconjunto de lecturas usando Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler y otros ensambladores seleccionados.

Visualice cada archivo de gráfico de ensamblaje usando bandage. Evalúe los contigs por circularidad, consistencia de tamaño entre ensambladores y evidencia de juntas quiméricas. Elimine los contigs lineales que carecen de soporte en múltiples ensambladores y mantenga los contigs circulares con estimaciones de tamaño consistentes.

Elimine los contigs sin soporte menor antes de la generación de consenso cuando los plásmidos principales estén circularizados. Proceda a la generación de consenso después de la curación manual. Genere la secuencia de consenso usando Autocycler con los ensamblajes curados.

Ejecute los comandos restantes de Autocycler para producir la secuencia de plásmido de consenso final. Por último, pula la asamblea final usando lecturas largas recortadas con Medaka para mejorar la precisión del consenso. Todas las pruebas de conjugación produjeron transconjugantes, confirmando la presencia de un plásmido conjugativo en los donantes.

Los tamaños de las secuencias de plásmidos ensambladas fueron congruentes con las estimaciones basadas en la movilidad de la electroforesis en gel de campo pulsado. La secuenciación nanopore produjo suficiente salida de lectura y calidad para todas las muestras analizadas. Las tasas de contaminación cromosómica variaron entre 72,1%y 28,0%con un promedio de 46,9%El análisis de electroforesis en gel de campo pulsado del plásmido de la cepa UPEC_271 reveló una banda correspondiente a un plásmido de aproximadamente 145 kilobases pares.

El ADN de uno de los transconjugantes mostró una secuencia idéntica a los 145 kilobases. El análisis de electroforesis en gel de campo pulsado de la cepa blood 100913 identificó dos plásmidos de aproximadamente 70 y 110 kilobases pares. La secuenciación nanopore confirmó dos ensamblajes de plásmidos de 71