Lactilación de lisina específica del sitio mediante expansión del código genético en E. coli y células de mamíferos

Desarrollamos un sistema de ARNt reloj/RS para superar la mimetización y las limitaciones enzimáticas, permitiendo la incorporación precisa de la lactilación de lisina para estudiar su sistema biológico. Este protocolo puede aplicarse para estudiar el metabolismo tumoral, las funciones enzimáticas y los sitios del reloj. Para empezar, co-transformar 50 microlitros de células químicamente competentes de Escherichia coli DH10B con aproximadamente 100 nanogramos cada uno de los plásmidos deseados. Incuba la mezcla de transformación sobre hielo durante 25 minutos y luego ponle un choque térmico a 42 grados Celsius durante 45 segundos.

Devuelve el tubo a hielo durante tres minutos. Añade 350 microlitros de medium Luria bertani y agita el tubo vigorosamente a 220 revoluciones por minuto durante una hora a 37 grados Celsius. Ahora se extiende el cultivo celular transformado sobre una placa de agar Luria bertani suplementada con ampicilina y cloranfenicol.

Incuba la placa a 37 grados Celsius durante 12 a 16 horas. Luego elige una sola colonia de la placa para inocular un cultivo inicial de cuatro mililitros e incubarlo durante la noche. Al día siguiente, ampliar el cultivo nocturno a 400 mililitros de medio Luria bertani que contenga ampicilina y cloranfenicol.

Agita vigorosamente el cultivo a 220 revoluciones por minuto y 37 grados Celsius hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance entre 0,6 y 0,8. A continuación, inducir el cultivo con 0,2% de L-arabinosa y una lisina lactil milimolar e incubar a 30 grados Celsius y 220 revoluciones por minuto durante 16 horas. Las celdas semilla se colocan en una placa de 12 pozos con una densidad de uno por diez a la potencia de cinco celdas por pozo, utilizando un mililitro de DMEM.

Incuba durante 24 horas hasta que la confluencia celular alcance entre el 70 y el 80%, y luego procede a la transfección. Para preparar la solución de ADN diluido, añadir 0,75 microgramos de plásmido que contenga reportero de sfGFP y pNeu-KlacRS en una proporción uno a uno en 38 microlitros de DMEM sin suero con alta glucosa. Pipetea suavemente arriba y abajo o haz un vórtice breve para mezclar.

Para preparar el reactivo de transfección diluido, añadir 2,25 microlitros de reactivo de transfección en 38 microlitros de DMEM sin suero con alta glucosa. Pipetea suavemente arriba y abajo tres o cuatro veces para mezclar bien. Añade inmediatamente el reactivo de transfección diluido a la solución de ADN diluido de una sola vez.

Ahora pipetea arriba y abajo tres o cuatro veces para mezclar el contenido e incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos para permitir que se formen los complejos de transfección y ADN. Añade 50 microlitros del complejo de transfección y ADN gota a gota sobre el medio en cada pozo y gira suavemente la placa para homogeneizar la mezcla. Seis horas después de la transfección, sustituir el medio por DMEM fresco que contenga una lactilisina milimolar y cultivar las células durante 24 a 48 horas.

En Escherichia coli, se produjo hENO1-89Klac de longitud completa cuando se añadió una lisina lactil milimolar al medio de crecimiento. El inmunoblot confirmó la presencia de hENO1-89Klac de longitud completa utilizando anticuerpos anti-etiqueta His y anti-L-lactil lisina. La espectrometría de masas de tiempo de ionización por electropulverización reveló un pico dominante en 48.178 Daltons, coincidiendo con la masa esperada de hENO1-89Klac sin la metionina inicial.

La espectrometría de masas tándem del tríptico digerido confirmó la incorporación específica de Klac en el Residuo 89 mediante la presencia de una serie completa de iones B&Y que mapea al péptido modificado. En células HEK293T de mamíferos, la microscopía de fluorescencia mostró una fuerte expresión de sfGFP en todas las células cuando se añadió Klac durante 24 y 48 horas, mientras que no se observó fluorescencia sin suplementación con Klac. La citometría de flujo reveló que aproximadamente el 31% de las células expresaban sfGFP tras 24 horas, aumentando hasta aproximadamente el 37% tras 48 horas de suplementación con Klac.

Este protocolo permite investigar los efectos específicos de la lactilación de la lisina en la función proteica y facilita la medición de los resultados biológicos y funcionales resultantes. Tras este procedimiento, los investigadores pueden realizar estudios mecanicistas, realizar ensayos de cribado de alto rendimiento y generar líneas celulares estables para un análisis funcional ampliado. Nuestros futuros estudios tienen como objetivo mejorar la eficiencia, permitir una integración estable y desarrollar la biosíntesis de relojes.