Modelo de rata canulada por conducto linfático cervical para evaluar el transporte linfático desde la cabeza y el cerebro

Nuestro proyecto examina cómo los linfáticos cerebrales se relacionan con las enfermedades del SNC, como el Alzheimer, el ictus y la neuroinflamación, identificando sustancias que se drenan del cerebro. Los métodos existentes carecían de un protocolo y un enfoque fiable para muestrear y cuantificar teóricamente el flujo linfático derivado del SNC, lo cual es posible por este protocolo. Para empezar, precarga aproximadamente 0,7 mililitros de solución anticoagulante diluida en una jeringuilla estéril de insulina de un mililitro con una aguja calibre 30 para recubrir la superficie interna de la cánula de polietileno.

Guarda la jeringuilla precargada en condiciones estériles hasta su uso. Para preparar cánulas, utiliza tubos con 0,5 milímetros de diámetro exterior y 0,3 milímetros de diámetro interior para ambas secciones terminales y tubos de 0,6 milímetros de diámetro exterior y 0,5 milímetros de diámetro interior para la sección central. Con tijeras, corta los segmentos de la cánula a longitudes de dos centímetros para la porción proximal que conecta con la aguja de la jeringuilla, 40 centímetros para la sección media y ocho centímetros para la parte distal destinada a la canulación.

Monta la cánula en configuración de cabeza a cola. Luego corta y bisela el extremo distal del conjunto de la cánula en un ángulo de aproximadamente 45 grados para facilitar una inserción suave en el conducto linfático cervical. Verifica la patencia de cada cánula conectando la jeringuilla precargada al extremo proximal de la cánula ensamblada.

Libera suavemente un pequeño volumen de solución para enjuagar la cánula. Asegúrate de que la solución salga suavemente por el extremo distal, sin indicios de fugas. Coloca a una rata anestesiada en posición supina sobre una almohadilla quirúrgica calentada mantenida a 37 grados Celsius.

Inclina la cabeza y extiende el cuello usando una pequeña almohada de soporte, si es necesario, para aumentar la exposición de la región cervical. Sujeta suavemente las extremidades anteriores usando gomas elásticas o cintas quirúrgicas para minimizar el movimiento. Enjuaga el pelaje de la región cervical con solución fisiológica normal estéril para facilitar el afeitado.

Después, afeita cuidadosamente todo el sitio quirúrgico para asegurar la eliminación completa del pelo antes de la incisión. Marque el lugar quirúrgico dibujando una línea punteada de 2,5 centímetros para confirmar la longitud de la incisión inicial. Coloque el extremo superior de la incisión aproximadamente entre uno y 1,5 centímetros por debajo del labio inferior.

Tras confirmar la profundidad anestésica mediante el reflejo de pellizco del dedo, incisa cuidadosamente la capa superficial de la musculatura cervical a lo largo de la línea marcada. Luego separa suavemente las capas musculares restantes, principalmente la fascia cervical superficial, para exponer la arteria cervical. Retrae el músculo esternomastoideo y la glándula submandibular, e inclínalos alejándolos del campo quirúrgico para facilitar la identificación del conducto linfático cervical.

Utiliza un expansor de tejido para mantener la ventana quirúrgica. Con un hisopo de algodón, sujeta temporalmente el tejido muscular mientras localizas el ganglio linfático y el conducto linfático asociado. Localiza el ducto linfático cervical opaco e incoloro que corre paralelo a la arteria carótida.

Con pinzas romas, pasa suavemente por los tejidos conectivos separados y mantén las pinzas en posición. Aislar cuidadosamente el conducto linfático cervical de los tejidos conectivos y adiposos circundantes mediante una disección roma. Luego haz una pequeña incisión en la mitad superior del vaso expuesto.

Se puede crear una pequeña punción secundaria cutánea a aproximadamente 1,5 centímetros de la ventana quirúrgica para servir como punto de fijación adicional para la cánula. Inserta la cánula por la segunda abertura, agarra su extremo distal con pinzas y asegúrate de que su cara biselada esté dirigida hacia arriba. Luego, inserta suavemente el extremo distal aproximadamente dos milímetros dentro del conducto linfático a través de la incisión, orientándolo hacia la cabeza.

Vigila el extremo proximal de la cánula durante uno o dos minutos. Confirma la canulación exitosa observando una salida lenta y constante de líquido linfático. Asegura la cánula aplicando una pequeña gota de adhesivo de tejido cianoacrilato con una pipeta en el lugar de la incisión y en el orificio secundario de fijación.

Observa el flujo linfático durante varios minutos para confirmar el flujo constante de la emisión. Después, retira cuidadosamente el expansor tisular y reposiciona la glándula submandibular en su ubicación original. Coloca un tubo microcentrífuga premarcado y recubierto de anticoagulante en el extremo distal de la cánula.

Luego recoloca todas las capas musculares en su ubicación original y cierra la incisión cutánea con suturas y/o adhesivo de tejido. Recoger linfa continuamente en tubos microcentrífugas recubiertos de anticoagulantes, reemplazando los tubos a intervalos predeterminados, normalmente cada hora. Asegúrate de que la rata permanezca anestesiada durante todo el periodo de recogida.

Guarda las muestras recogidas con bolsas de hielo en una nevera. Los caudales linfáticos horarios medidos durante un periodo de recogida de seis horas en ratas con canulación exitosa oscilaron entre 0,09 y 0,13 mililitros por hora. En ratas sanas, el transporte linfático acumulado de albúmina marcada con tritio administrada intraestriatal se mantuvo insignificante durante las dos primeras horas y aumentó sustancialmente después.

La comparación de las concentraciones de albúmina marcada con tritio entre linfa y plasma demostró diferentes perfiles de concentración a lo largo del tiempo en ratas sanas. La neuroinflamación inducida por la administración interperitoneal de lipopolisacáridos de Escherichia coli se asoció con una ligera reducción del flujo linfático total durante ocho horas y una reducción casi doble en la proporción de dosis total transportada a la linfa. La relación de concentración linfa-plasma no mostró diferencias significativas entre ratas sanas y neuroinflamadas, lo que indica perfiles similares de aclaración linfática cervical.

Este protocolo permitía muestreo biológico directo de linfa derivada del cerebro, conectando imágenes externas indirectas o métodos resinosos con una salida medible del sistema nervioso central. El protocolo permite estudiar la eliminación de fármacos administrada centralmente a través de vías linfáticas, permitiendo medir las rutas de drenaje y las tasas de eliminación. Estudios futuros pueden examinar cómo los estados de enfermedad del SNC alertan sobre la eliminación linfática y utilizar este conocimiento para optimizar fármacos que restauren la función linfática cerebral para el tratamiento.