Mapeando la inmunidad infantil con entrada mínima: perfilado integrativo de células únicas y multiómico

Nuestra investigación define cómo se adapta la inmunidad en la vida temprana tras el nacimiento mediante perfiles multiómicos longitudinales de alta dimensión a partir de pequeños volúmenes sanguíneos. Este protocolo puede aplicarse a estudios neonatales y pediátricos para el perfilado inmunitario longitudinal a partir de biomuestras limitadas en salud, infección e inflamación. Para empezar, descongela rápidamente un vial que contiene glóbulos rojos infantiles lisados en un baño maria a 37 grados Celsius.

Transfiere las celdas descongeladas a un tubo cónico de 15 mililitros que contiene 10 mililitros de medio RPMI completo y tibio a 37 grados Celsius. Centrifuga el tubo a 400 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y descarta el sobrenadante. Resuspende el pellet celular en tres mililitros de medio RPMI completo y cuenta el número total de celdas.

Diluye la muestra si la concentración es demasiado alta para contarla. Tras contar las células, repite el paso de centrifugación y vuelve a suspender las celdas en un medio RPMI completo para obtener una concentración de un millón de células por mililitro. Transfiere 100 microlitros que contengan 0,1 millones de celdas en cada pozo de una placa de fondo en V de 96 pozos.

Centrifuga la placa a 764 g durante dos minutos a cuatro grados Celsius. Descarta el sobrenadante. A continuación, añade 100 microlitros de tinte vivo y muerto diluido de uno a dos 000 en PBS con bloque FC y bloque de monocitos diluidos de uno a 100 a todas las muestras excepto al control sin tinte.

Incuba las muestras durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Para lavar las células, añade 100 microlitros de PBS. Centrifuga la placa a 764 g durante dos minutos a cuatro grados Celsius y descarta cuidadosamente el sobrenadante.

Añadir 100 microlitros de cóctel de anticuerpos superficiales, diluido de uno a 200 en el filtro de clasificación celular activada por fluorescencia, o tampón FACS, a todas las muestras excepto al control sin tinción. Incuba durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Luego lava las células con 100 microlitros de tampón FACS, centrifuga y descarta el sobrenadante.

Fija las células añadiendo 100 microlitros de paraformaldehído al 4% a cada muestra. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, luego lavar las células de nuevo y volver a suspender en 200 microlitros de tampón FACS. Prepara las perlas de compensación UltraComp como controles de un solo color.

Teñe las perlas de control de un solo color usando el mismo procedimiento que las muestras, incluyendo la fijación si las muestras estaban fijas. Además, prepara la fluorescencia sin uno o controles FMO de la misma manera. Ejecuta las muestras, controles de un solo color, controles sin tinción y controles fluorescentes menos uno en un citómetro de flujo convencional o espectral.

Abre FlowJo y selecciona la muestra de interés para analizar. Establece puertas usando los controles apropiados de isotipo y FMO. Aplicar leucocitos de compuerta usando FSC frente a SSC para excluir los residuos, y seleccionar células por tamaño y granularidad.

Excluye los dobletes usando FSCA frente a FSCH. Engatilla las células vivas usando un colorante de viabilidad para excluir las células muertas. A partir de células vivas individuales, se dividen en linfocitos CD33-negativos y células mieloides CD33-positivas.

Dentro de las células CD33-positivas, identificar monocitos CD14-positivos. Luego, dentro de las células CD33-positivas, identifica las células dendríticas CD14-negativas y CD11C-positivas. Ahora, entre los linfocitos CD33-negativos caminan células T CD3-positivas y células CD-3-negativas CD56-positivas.

Dentro de las células T CD3-positivas, identificar subconjuntos CD8-positivos y CD4-positivos e identificar células B CD3-negativas, CD56-negativas y CD19-positivas. Para empezar, descongela un vial de células lisadas con glóbulos rojos criopreservadas en un baño maria a 37 grados Celsius. Transfiere la suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de células T y centrifugar a 430 g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Descarta el sobrenadante. Tras volver a suspender el pellet celular con un mililitro de PBS, añade otros nueve mililitros de PBS a la muestra. Centrifuga el tubo a 430 g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y descarta el sobrenadante.

Cuenta las células y evalúa la viabilidad usando la exclusión de azul de tripán. Si la viabilidad es inferior al 70%, procede a usar un kit de eliminación de células muertas de la siguiente manera. Primero, preparar un tampón de unión 1x diluyendo una solución de base de tope de unión 20x con agua estéril destilada doblemente.

Resuspende la pelota celular en 100 microlitros de microperlas de eliminación de células muertas por cada 10 hasta la potencia total de siete células. Mezcla bien y incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. Coloque la columna de separación magnética en el soporte magnético correspondiente, junto con un tubo de recogida.

Luego equilibra la columna enjuagando con 500 microlitros de tampón de unión 1x. Reduce el volumen de suspensión de la celda a 500 microlitros con un buffer de unión 1x. Tras colocar el tubo de recogida, aplica la suspensión de celda a la columna y recoge el flujo en el nuevo tubo microcentrífuga de 1,7 mililitros.

A continuación, lava la columna dos veces con 500 microlitros de tampón de unión y recoge el flujo en el mismo tubo de microcentrífuga. Centrifuga el eluato a 300 g durante 10 minutos y descarta el sobrenadante. Cuenta las células y evalúa de nuevo la viabilidad usando la exclusión de azul de tripán.

Alicota 20.000 celdas viables en un nuevo tubo microcentrífuga de 1,7 mililitros. Luego centrifuga las células a 300 g durante 10 minutos y retira el sobrenadante. Resuspende las células con 40 microlitros de PBS que contengan 0,04% BSA.

Finalmente, coloque el tubo que contiene las células sobre hielo y envíelo inmediatamente a una instalación de núcleo genómico para la generación y secuenciación de bibliotecas. Recopila los resultados de secuenciación en formato de salidas de cell ranger. Se procesaron muestras de sangre seca de bebés prematuros y de controles.

Y se cuantificó la expresión proteica normalizada de 92 proteínas relacionadas con el sistema inmunitario. La expresión del gen tres de activación de linfocitos y del adaptador transmembrana regulador del umbral de señalización 1 fue significativamente mayor en sangre periférica de bebés prematuros a los dos meses de edad en comparación con la sangre de cordón a término. Se utilizó una estrategia integral de gating para identificar poblaciones de leucocitos a partir de muestras de glóbulos blancos lisadas por glóbulos rojos.

Dentro de la población de células T, se distinguieron subconjuntos positivos para CD4 y para CD8. Tras el filtrado, se capturaron y perfilaron más de 120.000 células en el conjunto de datos de secuenciación de ácidos ribonucleicos unicelulares. La reducción de dimensionalidad y el análisis de agrupamiento identificaron 14 agrupaciones celulares distintas.

Los grupos celulares se anotaron en función de genes expresados diferencialmente y marcadores celulares conocidos. 12 de los 14 grupos correspondían a linajes celulares inmunitarios, incluyendo células T, células natural killer, células B, mieloides y neutrófilos. Un gráfico de barras apiladas ilustraba la proporción relativa de células por cúmulo a lo largo de una semana, un mes y dos meses de edad.

Este estudio permite medir longitudinalmente firmas inmunitarias celulares, transcriptómicas, proteómicas y funcionales a partir de muestras de sangre de volumen limitado. Estudios futuros pueden utilizar estos métodos para definir trayectorias inmunitarias saludables y descubrir respuestas inmunitarias desreguladas en la vida temprana relacionadas con enfermedades.