Una técnica para estabilizar proteínas de membrana en nanodiscos

Este protocolo destaca un flujo de trabajo reproducible de reconstitución de nanodiscos con un marco de método generado. Los detergentes desestabilizan las proteínas de membrana. Los nanodiscos con MSP y lípidos perciben la estructura nativa para crio-EM y lisis.

Comienza añadiendo los componentes lipídicos preparados en cloroformo en un tubo de ensayo de vidrio para preparar una mezcla lipídica de 100 microlitros y mezcla bien. Evapora el cloroformo bajo un suave chorro de gas nitrógeno hasta que se haya eliminado todo el líquido. Añadir aproximadamente dos mililitros de n-pentano gota a gota al tubo de ensayo de vidrio y evaporar el disolvente usando gas nitrógeno para obtener una película lipídica seca y transparente.

Después de aflojar la tapa del tubo, colócalo en el desecador de vacío. Evacua el desecador y mantenlo bajo vacío para eliminar cualquier disolvente residual. Luego se retira la película lipídica del desecador al vacío y se añaden 250 microlitros de tampón sin detergente y bajo en sal para hidratar la película lipídica, obteniendo una concentración final de 10 miligramos por mililitro.

Tras volver a suspender el lípido, divídelo uniformemente en cuatro tubos de vidrio. Sonicar las suspensiones hasta que se vuelvan claras y transparentes, indicando la formación exitosa de liposomas. Luego enjuaga inmediatamente el espacio de cabeza de cada tubo con gas nitrógeno y guárdalo a menos 80 grados Celsius hasta su uso.

Tras la transformación de las células BL21 de E. coli con el plásmido MSP1D1, portando una etiqueta de 7-histidina y posterior expansión del cultivo. Induce la expresión de MSP añadiendo IPTG a una concentración final de 0,5 a un milimolar. Luego continúa cultivando las células a 16 grados Celsius durante 16 a 20 horas con agitación.

Centrifuga el cultivo bacteriano a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Descarta el sobrenadante y conserva la pastilla celular. Luego resuspende el pellet derivado de un litro de cultivo en 100 a 150 mililitros de tampón de lisis.

Homogeneizar a fondo hasta lograr una suspensión uniforme sin grumos visibles. A continuación, utiliza un disruptor de celdas ultrasónicas refrigeradas para romper la bacteria al 35% de potencia con ciclos de pulsos de tres segundos, seguidos de pausas de seis segundos. Continúa sonicando hasta que el lisado se despeje y se torne de color marrón claro.

Centrifugar el lisado a 30.000g durante 45 minutos a cuatro grados Celsius y recoger el sobrenadante para los siguientes pasos. Tras incubar el sobrenadante con resina de níquel-NTA equilibrada y lavar para eliminar impurezas, eluir la proteína objetivo con el tampón de elución y recoger las fracciones eluat. Continúa recogiendo fracciones hasta que la absorbancia del eluato a 280 nanómetros baje por debajo de 0,01.

Luego transfiere el eluato acumulado a un tubo de diálisis y diálisalo contra el tampón de diálisis a cuatro grados Celsius con una suave agitación durante la noche. Tras la diálisis, se concentra la solución utilizando un dispositivo de ultrafiltración para obtener una concentración final de MSP de dos a cinco miligramos por mililitro. Pesan aproximadamente 250 miligramos de bioperlas en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Añade entre 25 y 30 mililitros de metanol al tubo. Gira o haz un vórtice completo de la mezcla en la oscuridad. Después de incubar el tubo a cuatro grados Celsius durante 20 minutos, descarta cuidadosamente el sobrenadante y repite el lavado con metanol dos veces más.

Realiza lavados similares con agua destilada doble tres veces, luego añade entre 25 y 30 mililitros de tampón sin detergente y bajo en sal a las perlas. Sacude o gira el tubo sobre una mesa giratoria para mezclarlo e incubarlo, como se ha demostrado antes. Descarta el sobrenadante y repite el paso de equilibrio del buffer bajo en sales tres veces para acondicionar completamente las perlas.

Divide las bio-perlas activadas por igual en tres tubos microcentrífugas de 1,5 mililitros para su uso posterior. Recupera una alícuota del fondo lipídico prepreparado y descongélalo. Inmediatamente, centrifugar el tubo a 7.000g durante cinco segundos a cuatro grados Celsius para recoger el contenido en el fondo.

Ultrasonica el material lipídico en un baño maria al 60% de amplitud y controla la claridad y temperatura cada cinco a diez minutos para evitar el sobrecalentamiento. Continúa la sonicación hasta que el material lipídico se despeje y sea transparente. Calcula la cantidad molar de la proteína de membrana objetivo usando la ecuación presentada.

Luego calcula los volúmenes requeridos de MSP y soluciones de stock lipídico basándose en una proporción estequiométrica molar de proteína objetivo a MSP y lipídio de uno a cinco a 250. Combina los volúmenes correspondientes de lípidos y MSP para preparar una mezcla maestra de 300 microlitros e incuba en hielo durante 10 minutos. Luego añade lentamente 50 microlitros de la mezcla a la solución proteica concentrada mientras pipeteas suavemente para asegurar la homogeneidad.

Luego coloca la mezcla combinada sobre hielo durante una hora y invierte suavemente el tubo cada 15 minutos para mezclarlo bien. Ahora, toma una alicuota de las bioperlas preactivadas y aspira el tampón residual bajo en sal. Añade la solución proteica a las perlas e incuba rotando en la oscuridad durante una hora a cuatro grados Celsius.

Centrifuga la mezcla a 7.000g durante cinco segundos a cuatro grados Celsius. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante a una segunda alicota de bioperlas de la que se ha aspirado el tampón bajo en sal. Después de mezclar bien el contenido mediante una inversión suave, incubar en la oscuridad durante cuatro a ocho horas o durante toda la noche.

Una vez centrifugada brevemente la solución proteica, transfiere el sobrenadante a la tercera alitería de bioperlas preactivadas. Incubar con rotación a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante una hora. Tras una breve centrifugación, transfiere el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.

Centrifugar a 17.000g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos para eliminar los áridos. Tras purificar los complejos nanodisco TASK2 mediante cromatografía de exclusión de tamaño, agrupar las fracciones pico de la elución y concentrarlas hasta una concentración final de nanodisco en TASK2 de 1,2 a 1,5 miligramos por mililitro. Para verificar el ensamblaje del nanodisco, analiza las muestras utilizando SDS-PAGE al 12% y confirma la presencia de MSP y proteína de membrana objetivo.

El perfil de cromatografía de exclusión de tamaño mostró dos picos principales correspondientes al complejo de nanodiscos ensamblado con 15,1 mililitros y al MSP libre con 18,0 mililitros. La cuantificación de las áreas de pico mostró que el pico ensamblado del nanodisco tenía un área de 147,2. En contraste, el pico de MSP libre tenía un área de 31,5, lo que corresponde a una eficiencia de ensamblaje del 82,4% La comigración de la proteína objetivo y el MSP en SDS-PAGE confirmaron su incorporación en un único complejo de nanodiscos.

Este protocolo ayuda a los investigadores a estudiar la estructura de proteínas de membrana utilizando la constitución de nanodiscos de array. La parte más desafiante es optimizar la proporción entre la proteína de membrana, el MSP, y los lípidos. También se pueden realizar ensayos funcionales, resonancia plasmónica superficial y espectrometría de masas utilizando este procedimiento.