Muestreo ambiental de ADN en buques de avistamiento de ballenas para el monitoreo de cetáceos

Este protocolo proporciona un enfoque estandarizado para el muestreo de ADN electrónico de ballenas durante los cruceros de avistamiento de ballenas. Existen muchos métodos diferentes de muestreo de eADN. Esto dificulta el análisis comparativo de datos.

Nuestro protocolo ha sido optimizado para las condiciones ambientales y las salvaguardas frente a la contaminación. Con el apoyo de un laboratorio de radio de eADN, este protocolo puede ser llevado a cabo por no expertos y científicos ciudadanos durante actividades de avistamiento de ballenas y en todo el mundo. Para empezar, prepara materiales de documentación de campo, incluyendo las hojas de datos de campo y el protocolo de campo laminado paso a paso para la toma de muestras de ADN ambiental de cetáceos.

Coloca un marcador impermeable, dos filtros de eADN por hukeprint, un número suficiente de guantes y un contenedor dedicado para residuos en la caja. Prepara uno o más cubos rígidos adecuados para el tipo de embarcación y la configuración a bordo, un contenedor secundario de ADN ambiental y una bomba de agua peristáltica o de vacío portátil. Lleva guantes durante toda la manipulación del equipo y cambia los guantes entre tareas.

Para esterilizar el equipo, aplica una solución de lejía doméstica diluida salpicando uniformemente todas las superficies de los cubos, tapas, recipientes y tubos de la bomba. Enjuaga bien con agua del grifo tres veces. Lleva todos los materiales a bordo antes de que lleguen los pasajeros y guárdalos en una zona limpia designada.

Coordinar el momento de muestreo y la posición de la embarcación con la tripulación. Observa los patrones de emergencia en el agua para anticipar los inmersiones con ballena. Recoge 20 litros de agua de mar de la huella de la aletas lo antes posible, asegurando un retraso de no más de 10 minutos tras la inmersión de la ballena.

Obtener muestras de diversas regiones utilizando condiciones logísticas personalizadas y adecuadas a cada ubicación y tipo de embarcación. Si es necesario, transportar el agua recogida a una estación de filtración designada a bordo, evitando derrames. Registra la identidad de la especie, las coordenadas del sistema de posicionamiento geográfico, la hora y la identificación de la réplica de muestras en la hoja de datos.

Cambia los guantes antes de filtrar. Abre la bolsa del filtro y maneja el filtro solo por la salida. Introduce la entrada en el snorkel y luego conecta el tubo de la bomba a la salida.

Sumerge el snorkel en la muestra de agua sin sumergir la carcasa del filtro, y ajusta la bomba a un caudal rápido y constante. Filtra 10 litros de forma continua mientras monitorizas la estabilidad del caudal. Después, invierte el filtro y pon la bomba en marcha durante 30 a 60 segundos para eliminar el agua residual.

Personaliza la configuración de la bomba de filtrado según las condiciones del campo. Apaga la bomba y desconecta la tubería. Coloca el filtro en su bolsa original y etiquétalo inmediatamente.

Cambia los guantes y prepárate para realizar la filtración para la segunda réplica. Guarda los filtros ambientales de ADN autopreservativos en un recipiente seguro y seco en una habitación sombreada a temperatura ambiente. Refrigera los filtros si la temperatura ambiente supera los 20 grados Celsius y envia en un plazo de tres meses.

Realizar todos los procedimientos de laboratorio en habitaciones dedicadas a la esterilización ultravioleta con ventilación adecuada. Después de ponerte guantes y ropa protectora sin ADN, limpia bien los bancos de trabajo. Usando pinzas libres de ADN, pliega la membrana filtrante en triángulos y transfierela a un tubo de reacción de dos mililitros con la punta orientada hacia abajo.

Añadir un buffer de lisis de 400 microlitros compuesto por 380 microlitros de tampón TES y 20 microlitros de proteinasa K a cada tubo de reacción. Vórtice brevemente e incuba a 56 grados Celsius durante al menos tres horas con agitación. Coloca el filtro en una entrada de plástico con el fondo perforado y centrifuga a 18, 626G durante 10 minutos a temperatura ambiente para separar el tampón de lisis del filtro.

Reactivos de extracción de pipetas en placas de lavado y placas de elución. Utiliza placas de unión múltiple si el volumen total de lisado supera los 300 microlitros. Pulveriza partículas magnéticas en vórtice y añade 30 microlitros por pozo en la primera placa de unión.

Ejecuta el programa preliminar de captación de ADN para dos placas de unión y el posterior programa de extracción de ADN en el robot. Para ejecutar todas las reacciones QPCR en triplicado, prepara la mezcla maestra requerida en un espacio de trabajo dedicado y distribúyela entre los pozos. Añade tres microlitros de extracto estándar de ADN objetivo o extracto de eADN a cada pozo.

Tras sellar la placa PCR preparada, centrifugarla a 3.500G durante 10 segundos y la placa en el termociclador cuantitativo de PCR en tiempo real. Por último, realiza el ensayo bajo condiciones de ciclado optimizadas. Se recogieron 247 muestras de ADN ambiental o eDNA en la bahía de Skjalbandi, Islandia, y en las Azores, implicando la recogida de hasta 10 litros de agua de mar con dos filtros de eADN autopreservativos por huella.

Entre los 44 filtros de eADN analizados para el eADN de ballena jorobada, 20 proporcionaron señales de amplificación, mientras que 24 no mostraron amplificación. Los blanks de extracción, controles de campo y controles cuantitativos por PCR no mostraron amplificación detectable, lo que indica ausencia de contaminación. Entre las reacciones positivas, nueve filtros de eDNA produjeron al menos un umbral de ciclo por debajo del límite de detección, y se clasificaron como detecciones fiables.

Los 11 filtros EDNA restantes produjeron valores umbral de ciclo por encima del límite de detección, indicando detecciones plausibles. El valor umbral medio del ciclo fue ligeramente inferior en los filtros de ADN electrónico de las Azores, con alrededor de 34,7, en comparación con los filtros de Islandia, que tenían un valor de aproximadamente 36,9. La diferencia en los valores umbral del ciclo entre los filtros de ADN electrónico de Azores e Islandia no fue estadísticamente significativa.

Este protocolo puede utilizarse en futuras campañas a gran escala de muestreo de ADN electrónico para investigar la biodiversidad marina o la genética de poblaciones de ballenas. Este protocolo permite la detección y monitorización no invasiva de taxones de cetáceos y concurrentes mediante eADN contenido en huellas de aletas recogidas de embarcaciones de avistamiento de ballenas.