Name: Ensayo de citometría de flujo multiplex basado en perlas para el perfilado funcional de células T CAR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprende a realizar un ensayo multiplex basado en perlas para el perfilado funcional de células T CAR mediante citometría de flujo. Este método permite detectar simultáneamente múltiples citocinas y mediadores citotóxicos.

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<ol><li>Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+standardization+of+cytokine+profiling+in+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy.</a> Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).</li>
<li>Boulch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-talk+between+CAR+T+cell+subsets+and+the+tumor+microenvironment+is+essential+for+sustained+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity.</a> Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).</li>
<li>Teachey, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+predictive+biomarkers+for+cytokine+release+syndrome+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%3A+From+clinical+significance+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokines: From clinical significance to quantification.</a> Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+targets%3A+a+versatile+cell%E2%80%91free+platform+to+characterize+CAR+T+cell+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro.</a> Front Immunol. 15, 1254162(2024).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co%E2%80%91culture+model+with+CAR%E2%80%91T+cells%2C+antigen%E2%80%91presenting+cells%2C+and+tumor+cells+to+evaluate+CAR%E2%80%91T+cell%E2%80%91induced+cytokine+release+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome.</a> Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Bethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+fully+human+FOLR1-targeting+CAR+T+cells+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer.</a> Cells. 13 (22), 1880(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-125-800</td><td>Ensayo de citocina múltiple basado en bead para citometría de flujo</td></tr><tr><td>MACSPlex InspectoR Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Herramienta basada en web para gating y análisis automatizados de datos MACSPlex</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>Instrumento de citometría de flujo para medición de datos múltiples</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-803</td><td>Instrumento de citometría de flujo para medición de datos múltiples</td></tr><tr><td>MACSQuant Express Mode</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Software para gating y análisis automatizados</td></tr><tr><td>TexMACS Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-196</td><td>Medio de cultivo celular optimizado libre de suero desarrollado para el cultivo y expansión de células T humanas y de ratón</td></tr></tbody></table>

ensayo de citometría de flujo multiplex basado en perlas para el perfilado funcional de células t car

Bead-Based Multiplex Flow Cytometry Assay for Functional Profiling of CAR T Cells

Ensayo de citometría de flujo multiplex basado en perlas para el perfilado funcional de células T CAR

Profiling CAR T cells presents challenges due to their heterogeneity, complex immune responses, and limited sample availability. Multiplex assays enable ...

Nuestra investigación se centra en la caracterización funcional de las células T con CAR y ha desarrollado un ensayo multiplex compatible con citometría de flujo para perfilar la secreción de moléculas efectoras. Este procedimiento puede aplicarse a la investigación de células T con CAR para caracterización funcional, estudios mecanicistas, pruebas de control de calidad y evaluación de potencia.Para comenzar, prepare cultivos celulares de linfocitos T humanos modificados genéticamente con receptor de antígeno quimérico, o células CAR T, junto con células diana que expresen o carezcan del antígeno correspondiente, en una relación de células efectoras a células diana de 2,5 a 1. Defina uno o varios puntos de tiempo para la recolección del sobrenadante, con el fin de analizar citocinas secretadas o monitorear la cinética de citocinas durante un período de tiempo determinado.Reconstituya el estándar del analito agregando 200 microlitros de tampón o medio de cultivo celular al precipitado y mezcle suavemente. Prepare seis tubos de reactivo y realice una serie de diluciones uno a cinco del estándar reconstituido hasta 3,2 picogramos por mililitro, o 0,6 picogramos por mililitro. Prepare una muestra en blanco. A horas definidas posteriores al co-cultivo, centrifugue el co-cultivo a 300 ×g durante cinco minutos a 21 grados Celsius. Utilice los sobrenadantes directamente o dilúyalos para ajustarlos al rango de la curva estándar.Precaliente una placa de filtro MACSPlex con 200 microlitros de tampón MACSPlex por pocillo, y utilice un manifold de vacío o una centrífuga para aspirar hasta que los pocillos estén vacíos. Vortexe la mezcla de perlas de captura para resuspender completamente las perlas. Añada 50 microlitros del estándar o muestra y 20 microlitros de perlas pre-diluidas a los pocillos de una placa de filtro de 96 pocillos. Incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente con agitación a 450 rpm en la oscuridad. Lave los pocillos dos veces con 200 microlitros de tampón utilizando un manifold de vacío. Añada 100 microlitros del reactivo de detección 1 pre-diluido 1 a 50 a los pocillos. Incube durante una hora a temperatura ambiente con agitación a 450 rpm, en la oscuridad. Lave los pocillos dos veces. Añada 100 microlitros del reactivo de detección 2 pre-diluido 1 a 50 a los pocillos. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación a 450 rpm en la oscuridad. Lave los pocillos una vez y resuspenda las muestras en 200 microlitros de tampón.Utilice el código de barras 2D del vial de perlas de captura para cargar los ajustes de adquisición en el citómetro de flujo MACSQuant. Después de iniciar sesión en el software, seleccione la placa de filtro MACSPlex como soporte de muestras. Haga clic en el botón Código de barras de la barra de herramientas para activar el lector de códigos 2D. Acérquese al lector con el vial, orientando el código de barras hacia la luz intermitente, a una distancia de 0,5 a 2,5 centímetros. En la pestaña Autoretiqueta, asigne las Perlas de captura como MPx linfocito T citotóxico humano y célula asesina natural y seleccione Sin etiqueta. Defina las posiciones de grupo para las diluciones seriadas del estándar de linfocito T citotóxico y célula asesina natural. En la pestaña Ajustes, seleccione Modo rápido. Establezca el tipo como Análisis y el modo como MACSPlex_Estándar. Luego, aplique una mezcla suave. Asigne la muestra desconocida de forma similar y defina sus posiciones. Opcionalmente, agrupe las muestras e introduzca identificadores y descripciones de las muestras. En la pestaña Ajustes, seleccione nuevamente Modo rápido. Establezca el tipo como Análisis y el modo como MACSPlex_Muestra. En la tabla del experimento, verifique que las definiciones del soporte sean correctas. Asegúrese de que los niveles de líquido en los pocillos de la placa de filtro sean adecuados e inicie la medición. Utilizando los canales de ficoeritrina o PE, isotiocianato de fluoresceína o FITC y aloficoeritrina o APC, adquiera los datos en un citómetro de flujo equipado con láseres azul y rojo. Confirme que se estén utilizando las plantillas de modo rápido para el análisis automatizado de compuertas y datos en el citómetro de flujo MACSQuant. Alternativamente, cargue archivos de datos FSC o MQD en la herramienta web InspectoR para obtener mediciones cuantitativas automatizadas de citoquinas y resultados listos para exportar. Verifique la correcta separación de las 12 poblaciones diferentes de perlas de captura en el canal FITC frente a PE. Aplique la curva estándar para calcular las concentraciones de citoquinas. Finalmente, exporte y visualice los resultados.Mediante el uso de codificación de microesferas multiplex, se resolvieron claramente en el gráfico biaxial distintos grupos de microesferas que representan analitos individuales. Tras el co-cultivo con células diana tumorales, las células T con receptor quimérico de antígeno (CAR T) secretaron altos niveles de granzima B, interferón gamma o INF-gamma, factor de necrosis tumoral alfa o TNF-alfa y factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos o GM-CSF, lo que indica una activación potente y una función efectora citotóxica. Los niveles de interleucina-2 o IL-2 superaron el límite superior de detección, lo cual es consistente con una señalización proliferativa intensa. Las citocinas asociadas con respuestas de células T reguladoras o auxiliares alternativas, incluyendo IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 y la proteína quimioatractiva de monocitos 1 o MCP-1, estuvieron presentes en niveles bajos o cercanos a los límites de detección. Las células CAR T mostraron una liberación rápida y robusta de citocinas tras el reconocimiento de dianas positivas para el antígeno, con una fuerte sobreexpresión de granzima B, IFN-gamma, TNF-alpha, GM-CSF e IL-2 en un período de 8 a 24 horas, alcanzando niveles máximos a las 48 horas. También se observaron aumentos moderados de IL-6, IL-17A, IL-21 y perforina. Los niveles de IL-4, IL-10 y MCP-1 se mantuvieron bajos o ligeramente elevados. Los co-cultivos con dianas negativas para el antígeno mostraron una inducción mínima de citocinas en todos los analitos.Este protocolo permite la cuantificación de citoquinas, quimioquinas y mediadores citotóxicos que reflejan la activación de las células T con CAR y su función efectora. Las consideraciones más importantes en este protocolo son la duración de la co-cultura, la relación efectora a diana, la dilución de la muestra y el mantenimiento de niveles cuantificables de analitos. Tras seguir este procedimiento, el perfilado del sobrenadante puede combinarse con citometría de flujo, fenotipificación de células T con CAR o ensayos de citotoxicidad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El método IP-FCM se presenta, lo que permite un sensible, sólida evaluación, bioquímicos nativos de interacciones proteína-proteína, sin necesidad de la ingeniería genética o muestras de gran tamaño.

IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

Este video muestra un inmunoensayo múltiple basado en perlas para cuantificar múltiples objetivos de citocinas en una muestra. Se utiliza una mezcla de distintas microesferas conjugadas con anticuerpos específicos de citocinas para unirse a las citocinas presentes en la muestra. Los reporteros marcados con estreptavidina se inmovilizan en las citocinas unidas mediante anticuerpos de detección biotinilados. La citometría de flujo identifica las citocinas unidas en función de los tamaños únicos y...

Un inmunoensayo múltiple basado en perlas para cuantificar múltiples dianas citocinas

Este protocolo describe un ensayo de citotoxicidad sensible basado en células. Al enumerar la disminución de la frecuencia de linfocitos T CD4+ diana vivos en presencia de un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ efectores, este ensayo permite la evaluación directa de la actividad citolítica de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno.

Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

Análisis de la película del rasgón citoquinas ayuda en el estudio de varias enfermedades oculares. Ensayos multiplexores grano base son sencillas y sensibles y permiten el análisis de múltiples objetivos en muestras con pequeños volúmenes. Aquí se describe un protocolo para rasgar película del cytokine perfilar un uso grano base ensayo múltiple.

Perla base ensayo Multiplex para el análisis de perfiles de Cytokine de lágrima

Este protocolo describe la cuantificación de múltiples citoquinas objetivos simultáneamente en sobrenadantes de cultivo de tejidos de esplenocitos de ratón estimulados usando grano multiplex inmunoensayo basado en la plataforma y un citómetro de flujo.

Múltiplex del Cytokine Perfil de esplenocitos de ratón estimulados utilizando una plataforma basada en grano de cytometric del inmunoensayo

El aislamiento de células de implantes disecados y su caracterización por citometría de flujo puede contribuir significativamente a la comprensión del patrón de respuesta inmune contra implantes. En este trabajo se describe un método preciso para el aislamiento de células de implantes disecados y su tinción para el análisis citométrico de flujo.

Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados

Este informe describe un protocolo automatizado para ensayos de inmunofluorescencia múltiple (mIF) en un tintor de portaobjetos automatizado. Demuestra la alta reproducibilidad de la proteómica espacial en autotinciones tisulares estándar de alto rendimiento y generadores de imágenes de fluorescencia de portaobjetos completos, lo que es ideal para ensayos mIF personalizados en un gran número de portaobjetos de tejido en investigación traslacional.

Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

Aquí, describimos un método para crear gotas de doble emulsión que encapsulan una célula T y una célula diana cancerosa para examinar la muerte celular a nivel de una sola célula. Este método permite la cuantificación dual de las moléculas citotóxicas y la apoptosis de las células diana dentro de una gran población de células T.

Ensayo de citotoxicidad basado en gotas para evaluar las células T receptoras de antígenos quiméricos a nivel de una sola célula

Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un...

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

La citometría de flujo puede utilizarse para evaluar el estado de la cromatina dentro de las células T. Este protocolo permite a los científicos interpretan evidencia de descondensación de la cromatina durante la activación de las células T demostrada por un aumento en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de anticuerpos histona H3 fluorescentes...

El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

Aprende a realizar un ensayo multiplex basado en perlas para el perfilado funcional de células T CAR mediante citometría de flujo. Este método permite detectar simultáneamente múltiples citocinas y mediadores citotóxicos.

Ensayo de citometría de flujo multiplex basado en perlas para el perfilado funcional de células T CAR

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