Generación del modelo ratón de activación inmune materna gestacional temprana para evaluar la inflamación prenatal en el neurodesarrollo

Nuestro laboratorio estudia cómo la inflamación prenatal altera la biología de la microglía, las células inmunitarias del cerebro que contribuyen a resultados negativos en el neurodesarrollo. Los modelos existentes de MI se centran en la gestación media. Sin embargo, presentamos un protocolo gestacional temprano que, además, incorpora métricas de control de calidad para mejorar la supervivencia y la consistencia.

El modelo puede aplicarse a cualquier tipo silvestre o modelo genético de ratón para explorar el impacto de la inflamación ambiental en el desarrollo cerebral. Para empezar, instala dos hembras C57 BL6 de ocho a diez semanas con machos criadores C57 BL6 a última hora de la tarde o por la noche. A la mañana siguiente, evalúa las ratones hembras en busca de tapones vaginales y continúa revisando una vez al día hasta que se produzca el tapón.

Los bujóns son temporales y pueden caerse por la tarde, si no se revisan por la mañana. Tras confirmar el tapón vaginal, pesa la ratona hembra y registra el peso para monitorizar el estado del embarazo haciendo un seguimiento del aumento de peso durante la gestación. Separar a las hembras conectadas a jaulas individuales y mantenerlas bajo condiciones estándar de alojamiento con acceso ad libidum a comida y agua.

Designa a las hembras tapadas como día embrionario 0,5 y registra la fecha del tapón vaginal para asegurar un seguimiento preciso de la edad gestacional. Para reconstituir poli IC liofilizado en una solución de stock de alta concentración, disuelva en solución salina estéril o agua estéril según las instrucciones del fabricante. Vortex, la solución de stock de alta concentración.

Luego, diluye la solución en solución salina para preparar un material de baja concentración. Para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, calicuota aproximadamente 125 microlitros del material de baja concentración en tubos de 1,5 mililitros y almacena los tubos a 20 grados Celsius u 80 grados Celsius. Justo antes de la inyección, en el día embrionario 9,5.

Diluir el material de poli IC de baja concentración con solución salina estéril para obtener una concentración de trabajo. Calienta la pieza de trabajo a 65 grados Celsius durante 10 minutos para asegurar una correcta reaneación de la estructura del ácido ribonucleico de doble cadena. Luego se utiliza un vórtice o una pipete para asegurar una mezcla homogénea antes de la inyección.

Para confirmar el embarazo, pesa la presa en la mañana del día embrionario 9,5. Calcular el volumen de inyección de poli-IC para la activación inmune materna, o MIA, y el volumen de inyección salina del 0,9% para los controles. Extrae el volumen adecuado de la solución de trabajo poli-IC preparada o suero en una jeringuilla estéril de calibre 27 o menor.

Ahora, sujeta bien la presa para minimizar el dolor y la angustia. Inyecta el ácido poli-IC o la solución salina intraperitonealmente en el cuadrante inferior izquierdo o derecho, justo por encima del nivel de la cadera o en el segundo par de pezones. Luego desecha las jeringuillas en un recipiente BioSafety Sharps.

Además, registra la parte de la inyección para mantener la coherencia entre la cohorte. Devuelve inmediatamente la madre a la jaula de la casa y vigila cualquier signo de angustia. Luego suplementa la jaula con hidrogel durante al menos 24 horas después de la inyección para evitar la deshidratación asociada a la conducta de enfermedad.

Después de eso, registra el volumen inyectado de la dosis poli-IC, la fecha y hora de la inyección, la edad gestacional y el número de lote del poli-IC. Tres horas después de la inyección, observa a cada ratón individualmente durante un minuto y evalúa comportamientos como menor actividad, postura encorvada, muecas faciales o heces llorosas usando una escala de tres puntos. Clasificar a ratones que muestran uno o más de estos comportamientos como conductas de enfermedad aguda.

Luego, utilizando un método mínimamente invasivo como la hemorragia caudal, se recoge cuidadosamente la sangre materna de la presa inyectada. Recoge aproximadamente 50 microlitros de sangre. Tras confirmar la hemostasis, devuelva la presa a la jaula de casa.

Deja que la sangre recogida coagule durante 30 minutos a temperatura ambiente. Centrifuga la muestra a 2000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente para separar el suero del coágulo. Tras centrifugar la muestra de nuevo, recoge cuidadosamente la capa superior clara del suero sin alterar el coágulo.

Guarda el suero a 20 grados Celsius hasta que esté listo para el análisis posterior de citocinas. Después de la inyección, pesa las presas diariamente durante tres días para monitorizar la respuesta al ácido poli-IC. El día del parto previsto, registra los resultados de la camada incluyendo el tamaño de la camada, la viabilidad del cachorro o la ausencia de camada, para indicar un embarazo fallido.

Retira rápidamente cualquier cachorro fallecido y deshazte de ellos según las directrices de bioseguridad institucional. Utilice ensayos ELISA o multiplexados para cuantificar citocinas inflamatorias como IL-6 y TNF-alfa en suero materno tras MIA o inyecciones de control siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la cuantificación, utiliza los resultados para establecer un umbral representativo para la respuesta MIA.

Finalmente, realiza un análisis estadístico utilizando nuestro software para evaluar la relación entre los niveles séricos de IL-6 y TNF alfa en suero materno. Tras la administración de poli IC en el día embrionario 9,5, las presas MIA mostraron niveles significativamente mayores de IL-6 en comparación con las presas de control. Los niveles alfa de TNF mostraron una fuerte correlación positiva con los niveles maternos de IL-6.

Entre el día embrionario 0,5 y el día 9,5, las madres que lograron dar a luz con éxito una camada ganaron significativamente más peso que las madres que no lograron producir camada. Un día después de la inyección, las presas desaparecidas perdieron peso, mientras que las presas de control tratadas con solución salina ganaron peso. Pero para el día 12 embrionario, ambos grupos mostraron un aumento de peso similar.

El peso previo a la gestación no afectó la eficacia de la camada ni en las madres controladas con suero salino ni en las presas desaparecidas. Sin embargo, ratones C57 BL6 procedentes de Jackson Labs tuvieron camadas más exitosas que ratones C57 BL6 procedentes de Charles River durante el procedimiento MIA. En cambio, la fuente del poli IC no afectó a la eficacia de la camada.

Además, los animales procedentes de Jackson Labs presentaron una respuesta inflamatoria materna más robusta medida por suero IL-6 en comparación con los animales procedentes de Charles River. En cambio, la respuesta inflamatoria materna fue la misma entre las diferentes fuentes de poli IC. El protocolo permite la generación reproducible del modelo temprano de MIA y la correlación de la gravedad de la inflamación materna con los resultados experimentales de la descendencia. Es fundamental mantener registros detallados, registrar los números de lotes de reactivos y evaluar las respuestas maternas a las citocinas en todas las presas para garantizar resultados reproducibles.