Name: Producción rápida de ribonucleasa humana SLFN14 recombinante y análisis estequiométrico mediante fotometría de masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-20T14:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprende a producir rápidamente la ribonucleasa SLFN14 recombinante en células HEK293 y analiza su estequiometría mediante fotometría de masas. Este método facilita estudios bioquímicos y estructurales de ribonucleasas eucariotas.

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<ol><li>Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+ribosome-associated+endoribonuclease+slfn14+from+rabbit+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes.</a> Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).</li>
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<li>Murai, J., Thomas, A., Miettinen, M., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schlafen+11+%28slfn11%29%2C+a+restriction+factor+for+replicative+stress+induced+by+DNA-targeting+anti-cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Schlafen 11 (slfn11), a restriction factor for replicative stress induced by DNA-targeting anti-cancer therapies.</a> Pharmacol Ther. 201, 94-102 (2019).</li>
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<li>Mckenzie, E. A., Abbott, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Methods. 147, 40-49 (2018).</li>
<li>Shi, X., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+n-glycosylation+in+the+baculovirus-insect+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Protein n-glycosylation in the baculovirus-insect cell system.</a> Curr Drug Targets. 8 (10), 1116-1125 (2007).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanol (b-Me)</td><td>Sigma</td><td>M3148-500ML</td><td>14.3 M soluciones tack</td></tr><tr><td>AcquireMP 2024 R2</td><td>Refeyn</td><td>/</td><td>Software de adquisición de datos</td></tr><tr><td>Adenosina-5'-trifosfato sal disódica trihidrato (ATP)</td><td>Chem-Impex International</td><td>00015-100G</td><td>ajustar la solución a pH 7,0</td></tr><tr><td>Gel de afinidad anti-bandera M2</td><td>Millipore</td><td>A2220</td><td>Resina de afinidad anti-bandera</td></tr><tr><td>Hidrato de clorhidrato de benzamidina</td><td>Sigma</td><td>B6506-25G</td><td>Inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>Estándares de proteínas de amplio rango (10-250 kDa)</td><td>Bio-Rad</td><td>P7719S</td><td>Estándares de proteínas prestainadas</td></tr><tr><td>Condesa 3</td><td>Invitrogen</td><td>A49862</td><td>Contador de celdas automatizado</td></tr><tr><td>DiscoverMP v2024 R2</td><td>Refeyn</td><td>/</td><td>Software de análisis de datos</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Culata solución 1x</td></tr><tr><td>Péptido DYKDDDDK</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A36805</td><td>Péptido 3xFlag</td></tr><tr><td>Celdas FreeStyle 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>Células de suspensión de mamíferos</td></tr><tr><td>Nucleasa Geniust M DMF archivada</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-391121B</td><td>Nucleasa universal</td></tr><tr><td>HyClone CDM4HEK293 medios</td><td>Cytiva</td><td>SH3085802</td><td>Medio de crecimiento sin suero</td></tr><tr><td>Medios HyClone SFM4Transfx-293</td><td>Cytiva</td><td>SH3086002</td><td>Medio de transfección transitorio</td></tr><tr><td>Immersol 518F</td><td>Zeiss</td><td>4Y00-R0DY-1007-3BF3</td><td>Aceite de inmersión</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3032-02</td><td></td></tr><tr><td>Búfer de muestras de Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td>Culata solución 2x</td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>VWR</td><td>J580-25MG</td><td>Inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidrato (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>MassFerence P1&nbsp;</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-41033</td><td>Culata calibrante 500x</td></tr><tr><td>Kit de preparación de muestras UC de MassGlass</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-21022</td><td>Corredera y junta</td></tr><tr><td>Columna micro bio-espín</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td>columna de espín de polipropileno vacía</td></tr><tr><td>Sistema Milli-Q IQ 7000</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0C</td><td>Agua ultrapura tipo I</td></tr><tr><td>Geles Mini-Protean TGX libres de tintes</td><td>Bio-Rad</td><td>4568086</td><td>4-15% SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Minitron con humedad, refrigeración y CO2</td><td>Infors</td><td>72175</td><td>Agitador incubador</td></tr><tr><td>Kit de alineación MP</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-21019</td><td>herramienta de alineación, pinza de punta blanda, imán</td></tr><tr><td>Nanofotómetro</td><td>Implícito</td><td>NP80</td><td>Espectrofotómetro de visión ultravioleta</td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Clay Adams Brand</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-45036B</td><td>Inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>Productos de Investigación Internacional</td><td>P20270-25.0</td><td>Inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>Matraz de batido de policarbonato&nbsp;</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>WPFBC1000S</td><td>Matraz de base ventilado y con deflector</td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI) MW 40.000</td><td>Policiencias</td><td>24765</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Fluorómetro Qubit 4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P33226</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de alta sensibilidad para ARN de qubits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P32852</td><td>cuantificación usando colorante específico de ARN</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6065</td><td>Coomassie G-250</td></tr><tr><td>ADN plasmídico de expresión de SLFN14</td><td>Orígenes</td><td>RC226257</td><td>clon ORF etiquetado como humano</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Millipore</td><td>1.37017</td><td></td></tr><tr><td>Tris, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J60202. K2</td><td>1 M de solución bufferizada</td></tr><tr><td>Tris (2-carboxietil) fosfina cloruro (TCEP)</td><td>Biotecnología del Oro</td><td>TCEP10</td><td>TCEP</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>M143-1L</td><td>detergente</td></tr><tr><td>Tinte azul de tripán</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Acciones de solución al 0,4%</td></tr><tr><td>Preadolescentes 20</td><td>VWR</td><td>0777-1L</td><td>detergente</td></tr><tr><td>TwoMP</td><td>Refeyn</td><td>MP-PRO-00001</td><td>Fotómetro de masa</td></tr><tr><td>Columna Zeba 40K Desaltin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A57759</td><td>Cromatografía de exclusión por tamaño</td></tr></tbody></table>

producción rápida de ribonucleasa humana slfn14 recombinante y análisis estequiométrico mediante fotometría de masas

Rapid Production of Recombinant Human SLFN14 Ribonuclease and Stoichiometric Analysis by Mass Photometry

Producción rápida de ribonucleasa humana SLFN14 recombinante y análisis estequiométrico mediante fotometría de masas

Ribonucleases are a specialized class of RNA binding proteins that catalyze RNA cleavage and contribute to diverse biological processes including gene ...

rapid-production-recombinant-human-slfn14-ribonuclease-stoichiometric

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un nuevo método que implica el análisis cuantitativo de FRET (transferencia de energía por resonancia de Förster) señales se describe para el estudio de la cinética de enzimas.

Cuantitativo FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) Análisis para SENP1 Proteasa Determinación Kinetics

El ARN celular total proporciona una plantilla pobres para el estudio de los cambios a corto plazo en la síntesis de ARN y la descomposición, así como la cinética de procesamiento del ARN. A continuación, describimos marcaje metabólico de ARN recién transcrito con 4-tiouridina seguido por biotinilación específico de tiol y la purificación de ARN recién transcrito que permiten superar estas limitaciones.

Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular

Las exonucleasas desempeñan un papel fundamental para garantizar la estabilidad del genoma. La pérdida de la función de la exonucleasa WRN provoca un envejecimiento prematuro. El estudio de los sustratos y otros requisitos de la nucleasa in vitro puede ayudar a dilucidar su papel in vivo. Aquí demostramos un ensayo rápido y reproducible basado en fluorescencia para medir su actividad nucleasa.

Un ensayo de exonucleasa basado en fluorescencia para caracterizar DmWRNexo, ortólogo de la exonucleasa WRN progeroide humana, y su aplicación a otras nucleasas

Este protocolo describe cómo realizar ensayos de cuantificación absoluta de proteínas objetivo dentro de muestras biológicas complejas utilizando la monitorización de reacciones seleccionadas. Se utilizó para cuantificar con precisión las proteínas de la vía de señalización de la quimiotaxis de los macrófagos de ratón. Se describe en detalle la selección de péptidos objetivo, el desarrollo de ensayos y los ensayos cualitativos y cuantitativos.

Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación

Este protocolo describe el uso combinatorio de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq y perfiles para las líneas celulares y células primarias del ribosoma. Permite el seguimiento de cambios en el factor de transcripción vinculante, novo de transcripción, procesamiento de RNA, rotación y traducción con el tiempo y viendo el curso general de los acontecimientos en las células activadas o cambiantes.

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Se describe un método para generar y amplificar genéticamente modificados virus sincitiales respiratorios (RSVs) y un ensayo de placa optimizada para RSVs. Ilustramos este protocolo mediante la creación de dos virus recombinantes que respectivamente permiten cuantificación de replicación RSV y análisis de cuerpos de inclusión de RSV y gránulos asociada a cuerpos de inclusión dinámica en vivo.

Generación, amplificación y titulación de virus sincitiales respiratorios recombinantes

Aquí, describimos un protocolo detallado para un método de secuenciación basado en LC-MS que se puede utilizar como método directo para secuenciar ARN corto (&lt;35 nt por ejecución) sin un intermedio de ADNc, y como método general para secuenciar diferentes modificaciones de nucleótidos en un solo estudio con precisión de una sola base.

2D-HELS MS Seq: Un método general basado en LC-MS para la secuenciación directa y de novo de mezclas de ARN con diferentes modificaciones de nucleótidos

La transferencia de energía de fluorescencia de molécula única es un método que rastrea la dinámica del ARNt durante la síntesis de proteínas ribosómicas. Al rastrear ribosomas individuales, se identifican poblaciones no homogéneas, lo que arroja luz sobre los mecanismos. Este método se puede utilizar para rastrear cambios biológicos conformacionales en general para revelar relaciones de función dinámica en muchos otros biosistemas complejados. Los métodos de molécula única pueden observar...

Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

Se demuestra un protocolo detallado para sintetizar nanopartículas lipídicas (LNPs) utilizando tecnologías de mezcladores de chorro de impacto confinado (CIJ), incluyendo un CIJ de dos chorros y un mezclador de vórtice de entrada múltiple de cuatro chorros (μMIVM). Los mezcladores CIJ generan entornos de micromezcla turbulentos y reproducibles, lo que da como resultado la producción de LNP monodispersos.

Síntesis de nanopartículas lipídicas por flujo turbulento en mezcladores de chorro de impacto confinados

Presentamos un protocolo actualizado para la producción del sistema OnePot 'Protein synthesis Using Recombinant Elements' (PURE) y ribosomas crudos para la síntesis de proteínas libres de células, centrándonos en el control del crecimiento celular para minimizar las variaciones de lote a lote.

Refinamiento de OnePot PURE y producción de ribosomas crudos para la síntesis de proteínas libres de células reproducibles

Este protocolo describe la producción y purificación recombinante de la hidrofobina SC16 de Escherichia coli y proporciona ensayos basados en fluorescencia para monitorizar su autoensamblaje.

Producción y purificación recombinante de hidrofobina SC16 a partir de Escherichia coli y monitorización de su autoensamblaje mediante ensayos de fluorescencia

Aprende a producir rápidamente la ribonucleasa SLFN14 recombinante en células HEK293 y analiza su estequiometría mediante fotometría de masas. Este método facilita estudios bioquímicos y estructurales de ribonucleasas eucariotas.

Producción rápida de ribonucleasa humana SLFN14 recombinante y análisis estequiométrico mediante fotometría de masas

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