Mapeo de la morfología de las células estrelladas hepáticas en modelos murinos de fibrosis hepática

Este protocolo presenta una cadena de imagen completa para visualizar y modelar la morfología de las células estrelladas hepáticas en tejido hepático intacto. La imagen 2D actual carece de la morfología celular estrellada completa, limitando los conocimientos estructurales y funcionales. Este protocolo permite capturas robustas de arquitectura 3D compleja.

Para empezar, pellizca las palmas de un ratón anestesiado para asegurar una anestesia adecuada. Rocía el abdomen con etanol al 70% para mojar el pelaje. Con un par de pinzas, recoge la piel en el centro del abdomen alineada con las patas traseras y comienza a cortar la piel para revelar el abdomen.

Luego usa hisopos de algodón humedecidos con PBS para mover los intestinos y otros órganos hacia un lado y levantar el lóbulo izquierdo. Corta cuidadosamente la membrana unida entre el lóbulo izquierdo y el lóbulo caudado. Luego usa una sutura para atar en la base superior del lóbulo izquierdo.

Corta el lóbulo izquierdo por debajo del nudo de sutura y déjalo a un lado para la recogida y procesamiento de muestras de tejido. Utiliza hisopos de algodón mojados con PBS para mover el hígado y revelar la vena porta. Luego inserta cuidadosamente la aguja del catéter en la vena porta aproximadamente a mitad de su longitud.

Quita la aguja del catéter. Asegura un retroflujo de sangre a través del catéter para indicar la inserción exitosa. Conecta el tubo lleno de la bomba de perfusión en funcionamiento al catéter y perfunde el hígado con 20 mililitros de PBS.

Pinza la arteria pulmonar por encima del hígado con un hemostático para evitar que el PBS atraviese el corazón. Corta la vena cava inferior para liberar la acumulación de presión. Ajusta la velocidad de la bomba a cinco mililitros por minuto.

Después de 15 minutos, detener la bomba para cambiar el depósito a paraformaldehído al 4% y luego perfundir el hígado con 25 mililitros de paraformaldehído al 4%. Una vez completada la perfusión, se extrae el hígado de los órganos circundantes cortando los tejidos conectados. Coloca el hígado en un tubo cónico de 50 mililitros lleno con 25 mililitros de paraformaldehído al 4%.

Coloca el tubo horizontalmente sobre una plataforma de mecedora durante la noche en una sala fría a cuatro grados Celsius a 1,5 revoluciones por minuto. Al día siguiente, lava el hígado tres veces en PBS sobre una plataforma de mecedora durante 30 minutos cada una a temperatura ambiente a 1,5 revoluciones por minuto. Transfiere el hígado a 20 mililitros de PBS con azida sódica al 0,02% y almacene a cuatro grados Celsius.

Corta las muestras de hígado en trozos de aproximadamente 0,5 a 1 centímetro cúbico. Transfiere las muestras de hígado a frascos de vidrio con tapas de rosca. Deshidrata las muestras en una serie de metanol diluido en agua del 20% al 80% sobre un rotador de rueda a ocho rotaciones por minuto durante una hora cada una a temperatura ambiente.

Tras realizar el blanqueamiento, permeabilización, inmunomarcaje y limpieza, incubar la muestra en éter dibenzílico durante la noche a temperatura ambiente antes de la imagen. Las muestras pueden almacenarse en éter dibenzílico hasta un año sin pérdida de la señal de tinción. Para la imagen confocal, coloca la muestra despejada en un recipiente de fondo de cristal de 35 milímetros con fondo de vidrio número 1,5.

Rellena el plato con etílica caninato para sumergir completamente la muestra. Luego coloca el plato en el escenario del microscopio confocal. Adquirir una imagen de mosaico en el plano más brillante para capturar una gran área de la muestra usando el formato 1024 por 1024 y una velocidad de 600.

En función de la imagen de mosaico, selecciona regiones de interés para obtener un escaneo Z de mayor resolución. A continuación, adquiere una pila Z que abarca toda la profundidad del tejido eliminado a la máxima resolución soportada por el microscopio usando un formato de 1024 por 1024 y una velocidad de escaneo de 600. La perfusión y fijación exitosas del hígado del ratón resultó en un color uniforme pálido, beige amarillo.

Una perfusión inadecuada resultó en regiones de coágulos de sangre rojo oscuro o marrón, lo que redujo la claridad óptica y provocó una señal de fondo alta en estas regiones. Se logró transparencia óptica completa tras la incubación en éter dibenzílico, donde el tejido parecía despejado en comparación con antes de la limpieza. Los pilas Z de alta resolución revelaron procesos dendríticos finos que se extendían desde el cuerpo celular de células estrelladas hepáticas individuales.

Tanto las muestras de hígado de tetracloruro de carbono de control como las crónicas mostraron señales fluorescentes fuertes y estables bajo microscopía confocal. Esta tubería mapea de forma reproducible la morfología de las células estrelladas en el complejo servidor del microambiente, capturando procesos dendríticos y relaciones espaciales con células vecinas. El compromiso de tiempo es una consideración importante al realizar el protocolo.

El proceso de compensación dura aproximadamente tres semanas, lo que requiere una planificación previa. Permitiendo un análisis morfométrico 3D preciso, esta plataforma vincula la estructura de los fibroblastos con las funciones, avanzando en conocimientos sobre la homeostasis tisular y un mecanismo Z.