Aislamiento y purificación de islotes pancreáticos a partir de ratas Lewis mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad

Nuestra investigación se centra en desarrollar un protocolo estandarizado de aislamiento de ojales Lewis Rat de alto rendimiento para optimizar rendimiento, pureza, viabilidad y longevidad funcional. Los métodos existentes producen ojales variables impuros y de corta duración. Este protocolo estandariza la digestión, purificación y agrupación para mejorar la consistencia y la longevidad.

Para empezar, pon una rata eutanasiada bajo un microscopio. Con tijeras para la piel, realiza una incisión en forma de V que comienza desde la síntesis púbica hacia cada caja torácica lateral para acceder a la cavidad abdominal. Utilizando pinzas planas, retrae el intestino delgado y grueso hacia el lado izquierdo del animal para despejar el espacio de trabajo de la cavidad abdominal.

Luego usa las pinzas planas y los hemostáticos curvos para desplegar el duodeno superior. Asegúrate de que el conducto biliar común y la vena porta hepática estén dentro del campo de visión. Ahora utiliza los hemostatos curvos para retraer el hígado en la dirección del cefalón.

Pinza el conducto biliar común y la vena hepática a uno o dos milímetros del hígado. Bajo la vista del microscopio, con pinzas planas y hemostáticos planos, moviliza suavemente el contenido dentro del duodeno para eliminar el esfínter de la audición. Luego, sujeta suavemente el duodeno aproximadamente cinco milímetros de cada lado del esfínter de Audi para aislar la región circundante.

Asegúrate de una compresión mínima para preservar la integridad del tejido. Inserta cuidadosamente la aguja de una jeringuilla que contiene WDM estéril a través de la pared duodenal. Pasa la aguja por el cuerpo del esfínter y avanza hacia el conducto pancreático principal para la perfusión.

Manteniendo una presión constante, se perfunde entre siete y diez mililitros de WDM en el páncreas a una velocidad de unos 500 microlitros por segundo hasta que el páncreas esté completamente distendido. Ahora, retira ambos hemostatos planos del duodeno. Luego disecciona suavemente y libera el páncreas de las estructuras circundantes comenzando por el bazo, el estómago, el intestino grueso, el duodeno y el mesenario.

Levanta suavemente el páncreas perfundido con pinzas planas y utiliza tijeras finas de disección para cortar cualquier unión restante del tejido conectivo. Transfiere inmediatamente el páncreas extirpado a una placa de Petri que contenga una solución de enjuague fría y proceda a extraer el siguiente páncreas mientras se limpia el páncreas extirpado. Para limpiar el páncreas, se utiliza un par de pinzas finas curvas y unas tijeras finas de disección para eliminar cuidadosamente ganglios linfáticos, tejido adiposo, mesentario y vasculaturas grandes del páncreas perfundido si están presentes.

Transfiere el páncreas limpio a un vaso estéril de 600 mililitros que contenga 25 mililitros de WDM en frío. Cubre el vaso con papel de aluminio estéril para mantener la limpieza durante la transferencia del espacio quirúrgico al de cultivo celular. Transfiere el vaso a un baño de agua agitador orbital ajustado a 130 revoluciones por minuto durante 10 minutos.

A los cinco minutos, gira manualmente el vaso en sentido horario y luego en sentido antihorario para ayudar a la disociación del tejido. A los 10 minutos, transfiere rápidamente el vaso y sumergiérselo en hielo para ralentizar la actividad enzimática. Luego añade un volumen igual de tampón de temple a la solución del vaso para detener la digestión.

Utilizando una jeringuilla de 50 mililitros equipada con una aguja espinal calibre 14, aspira y expulsa suavemente la suspensión tisular repetidamente para disociar fragmentos grandes de tejido. Transfiere la suspensión a tubos cónicos de 200 mililitros. Tras centrifugar la suspensión, decantar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 100 mililitros de medio de lavado.

Ahora filtra la suspensión a través de un tamiz estéril de 500 micrómetros colocado sobre un vaso de precipitados estéril de 600 mililitros para eliminar el tejido grande sin digerir. Transfiere el filtrado a nuevos tubos cónicos de 200 mililitros antes de centrifugar de nuevo. Para la purificación de ojales, se utiliza una pipeta serológica pre-casada de 10 mililitros para resuspender cada pellet de tejido en 15 mililitros de solución gradiente por cada dos mililitros de volumen de pellet.

Mezcla suavemente hasta que la suspensión sea uniforme. Dispensar cuidadosamente 15 mililitros de la suspensión de celda en la parte inferior de cada tubo cónico de 50 mililitros, evitando el contacto con las paredes del tubo para asegurar gradientes limpios. Luego utiliza una bomba de jeringuilla para dispensar 10 mililitros de cada gradiente a una velocidad de cinco mililitros por minuto, mientras se coloca la punta de la aguja calibre 16 contra la pared interna del tubo para evitar la mezcla.

Tras centrifugar los tubos, identifica la capa de ojal situada en las interfaces entre las capas de gradiente. Utilizando una pipeta de pasante de paso, recoge la capa de ojales y transfiere los ojales recogidos a un tubo cónico de 200 mililitros preenfriado que contiene cinco mililitros de medio de lavado. Sube el volumen a 200 mililitros con el medio de lavado y realiza los siguientes pasos de lavado y centrifugación.

Luego, emplacar uniformemente los ojales en placas de Petri de 100 milímetros tratadas sin cultivo de tejidos usando una placa por cada cinco páncreas procesados. En todo el aislamiento de prueba, el rendimiento fue de 3.330 equivalentes de ojales por páncreas con un diámetro medio de ojales en el compartimento de 50 a 100 micrómetros. El tamaño automatizado arrojó 98.832 objetos en total, lo que se correlacionó fuertemente con los equivalentes manuales de párpados medidos en el día cero.

La pureza endocrina fue de aproximadamente el 98,56% según la tinción con ditozona al primer día. Los índices de estimulación fueron 9,37 en el primer día, 8,34 en el tercer día y 6,7 en el séptimo, sin diferencias significativas entre los puntos temporales. Este método permite el estudio del trasplante de ojos, la función de las células beta, la reversión de la diabetes, la encapsulación de ojales y las interacciones inmunes o microambientales de los ojos.

Este protocolo puede ser aplicable a trasplantes preclínicos, modelado de diabetes, estudios de encapsulación y ensayos funcionales in vitro que requieren ojales Lewis Rat de alta pureza.