Protocolo para la Disociación de Células Individuales, Secuenciación de ARN y Aislamiento de Células Mioepiteliales y Fibroblastos de las Glándulas Lagrimales y Salivales Envejecidas
24 de abril de 2026
Este protocolo describe un método optimizado para disociar glándulas lagrimales de ratón envejecidas y obtener células individuales viables para la secuenciación de ARN unicelular. La digestión enzimática secuencial y el manejo suave preservan la integridad celular, produciendo suspensiones de alta calidad adecuadas para el aislamiento específico de cada tipo celular y el análisis transcriptómico de cambios asociados al envejecimiento en poblaciones de glándulas lacrimales.
Mi laboratorio estudia cómo los cambios relacionados con la edad en las glándulas salivales y lagrimales afectan a diferentes tipos celulares utilizando citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular. Los métodos estándar de disociación recuperan mal células epiteliales frágiles de las glándulas salivales y lagrimales envejecidas. Y mi protocolo mejora la viabilidad de las células y permite un análisis y clasificación de células únicas fiables.
Para empezar, coloca al ratón eutanasiado en recostado sobre la mesa de disección. Con pinzas finas y tijeras, incide la piel entre el ojo y el oído. Retrae suavemente la piel para exponer la glándula lagrimal.
Con pinzas de punta opaca, levanta ligeramente la glándula lagrimal. Separa cuidadosamente el tejido conectivo circundante desplazándolo suavemente en un movimiento circular. Identifica los límites visibles de la glándula lagrimal y sepárala de los tejidos adyacentes, incluida la glándula parótida.
Luego transfiere la glándula lagrimal a una placa de Petri de 35 milímetros que contiene dos mililitros de PBS frío sobre hielo. Bajo un microscopio disecador, retirar la grasa restante y retirar cuidadosamente la cápsula de tejido conectivo de la glándula lagrimal. Coloca una placa de Petri estéril de 35 milímetros sobre hielo.
Añade entre 800 y 1000 microlitros de PBS frío en el centro del plato y transfiere una glándula lagrimal al PBS. Asegúrese de que el tejido permanezca sumergido en PBS. Con dos bisturíes estériles, pica finamente la glándula lagrimalical en pequeños fragmentos hasta que alcance una consistencia suave y pasta.
Recoge los fragmentos de tejido a un lado del plato. Aspira el PBS residual y lava los fragmentos con un mililitro de PBS fresco y frío. Transfiere los fragmentos de tejido lavados a una placa de 12 pozos que contenga dos mililitros por pozo de medio digerente precalentado.
Coloca la placa en un baño maria agitante e incuba a 37 grados Celsius y 60 revoluciones por minuto durante 30 minutos. Utilizando una punta de pipeta de un mililitro de ánima ancha, tritura suavemente el tejido 15 veces. Vuelve a colocar el plato en el baño maria agitado y incuba durante 30 minutos más.
A continuación, usando una punta de piquita normal de un mililitro, tritura suavemente la muestra 10 veces y vuelve a incubar durante 30 minutos. Luego trituren suavemente la muestra 10 veces y transfieran la suspensión celular a tubos microcentrífugas dolphin de dos mililitros. Añade un mililitro de medio bloqueador en frío uno, o BM1, a cada pozo de la placa para recoger el medio digestivo restante que contiene células residuales y colocar la placa sobre hielo hasta el siguiente paso.
Centrifuga los tubos que contienen la suspensión de la celda a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Descarta el sobrenadante de cada tubo. Transfiere el BM1 de cada pozo de la placa que contiene las celdas residuales al tubo correspondiente.
A continuación, añade 600 microlitros de BM1 frío a cada pozo para enjuagar las celdas restantes y transfiere el lavado al tubo correspondiente para combinarlo con la suspensión de celdas. Suspende suavemente la suspensión de la celda. Centrifugar los tubos de nuevo a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y descartar el sobrenadante.
Añade un mililitro de Accutase a los pellets celulares y resuspende suavemente las células. Incuba el tubo a 37 grados Celsius y 60 revoluciones por minuto durante cinco a diez minutos. Usando una punta de una pipeta de un mililitro, tritura suavemente la muestra 10 veces.
Luego añade un mililitro de BM2 frío al tubo para terminar la reacción enzimática diluyendo la Accutasa. Centrifuga el tubo a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y descarta el sobrenadante. Añadir un medio que contenga DNasa 1 a una concentración de 200 unidades por mililitro al tubo para volver a suspender las células y llenar el tubo hasta la parte superior.
Incuba el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente y vuelve a suspender suavemente una vez después de cinco minutos. Mientras tanto, coloca un colador de celda de 70 micrómetros sobre un tubo cónico de 15 mililitros y prehumedece el colador con un mililitro de BM3. Tras la incubación, transfiere la suspensión celular al colador.
Añade un mililitro de BM3 al tubo original para enjuagarlo y transfiere el enjuague al mismo colador. Lava el colador con cinco mililitros adicionales de BM3. Finalmente, determinar la concentración celular y la viabilidad de la suspensión filtrada mediante tinción azul tripánica y un contador celular automatizado.
Proceder con aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ARN unicelular para perfilado de expresión génica, o la clasificación celular basada en citometría de flujo de poblaciones celulares marcadas con fluorescencia. El análisis UMAP de datos de secuenciación de ARN unicelular identificó poblaciones epiteliales y estromales bien representadas en la glándula lacrimal, incluyendo células mioepiteliales y fibroblastos, así como diversas poblaciones de células inmunitarias. Las glándulas lacrimales envejecidas contenían abundante plasma y células B activadas que expresaban IGHM e IGHD.
La citometría secuencial de flujo permitió separar claramente las células mioepiteliales positivas para EpCAM y GFP positivas de las células mural negativas para EpCAM y positivas para GFP. Los fibroblastos positivos para GFP que expresaban PDGFR alfa eran negativos para EpCAM, permitiendo la discriminación de células epiteliales. En ratones PDGFR alfa y EGFP, todas las células positivas para GFP también expresaron colágeno uno, confirmando la identidad de los fibroblastos.
El análisis de citometría de flujo mostró que el 99,6% de las células positivas para GFP correspondían a células inmunotintadas por PDGFR alfa. Este protocolo está diseñado para aislar células individuales viables de glándulas lagrimales para la caracterización molecular de poblaciones epiteliales, estromales e inmunes. El principal desafío es minimizar el estrés mecánico y enzimático durante la disociación de tejido frágil y envejecido, al tiempo que se mantiene una alta viabilidad celular para la secuenciación de ARN unicelular.
Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar células aisladas para la secuenciación de ARN unicelular, la secuenciación de ARN a granel y el perfilado molecular de poblaciones celulares específicas. Las células clasificadas también pueden cultivarse para ensayos funcionales posteriores.
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Overview
This article presents an optimized protocol for isolating viable single cells from aged mouse lacrimal glands (LGs), enabling high-quality single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and flow cytometry analysis. The method addresses challenges posed by increased fibrosis, cellular fragility, and lipid accumulation in aged LGs, ensuring efficient dissociation and recovery of diverse cell types for downstream molecular profiling.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular biology
- Ophthalmology and exocrine gland research
- Single-cell transcriptomics
Background
- Aging of the lacrimal gland leads to reduced tear secretion and chronic inflammation, contributing to dry eye disease.
- Age-related changes include immune cell infiltration, cellular damage, lipid accumulation, extracellular matrix deposition, and ductal dilation.
- Single-cell RNA sequencing is a powerful tool for profiling cellular heterogeneity and transcriptional changes during aging.
- Obtaining viable single-cell suspensions from aged LGs is technically challenging due to tissue fragility and fibrosis.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for efficient dissociation of aged mouse lacrimal glands.
- To enable isolation of multiple cell types suitable for scRNA-seq and flow cytometry.
- To minimize cell damage and maximize viability during tissue processing.
Methods Used
- Careful dissection and mincing of lacrimal gland tissue from euthanized mice.
- Stepwise enzymatic digestion using Collagenase IV, Dispase II, DNase I, and Accutase.
- Use of pre-coated plasticware and controlled temperature/agitation to reduce cell stress.
- Red blood cell lysis and sequential filtration through strainers to enhance cell purity.
- Cell type-specific isolation using reporter mouse lines (Acta2GFP and PdgfraEGFP) and fluorescence-activated cell sorting (FACS) after immunostaining with EpCAM antibody.
Main Results
- The protocol yields high-quality, viable single-cell suspensions from both aged and young lacrimal glands.
- UMAP analysis of scRNA-seq data identified well-represented epithelial, stromal, and diverse immune cell populations.
- FACS enabled clear separation and identification of myoepithelial cells (EpCAM+, GFP+) and fibroblasts (PDGFRα+, EpCAM-).
- In aged LGs, abundant plasma and activated B cells expressing IGHM and IGHD were detected.
- 99.6% of GFP-positive cells corresponded to PDGFRα-immunostained fibroblasts, confirming cell identity.
Conclusions
- This protocol enables efficient and gentle dissociation of aged lacrimal glands for single-cell analysis.
- It supports high cell viability and recovery of multiple cell types, including fragile epithelial and stromal populations.
- The method is adaptable to other fibrotic or aging exocrine tissues requiring targeted cell isolation.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Efficient single-cell dissociation and isolation from aged lacrimal and salivary glands addresses a critical bottleneck in profiling cellular heterogeneity and transcriptional changes associated with tissue aging and fibrosis. This protocol enables high-viability recovery of fragile epithelial and stromal populations, supporting robust single-cell RNA sequencing and targeted cell sorting for discovery-stage research. The method enhances predictive confidence in cell-type specific molecular characterization, informing early target validation and mechanistic de-risking in exocrine gland disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of age-related cellular and molecular changes in exocrine tissues.
- Supports functional target validation by isolating viable myoepithelial cells and fibroblasts for downstream analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing high-quality single-cell suspensions for transcriptomic profiling.
- Improves predictive confidence in disease-relevant system modeling for dry eye and related disorders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell suspensions suitable for high-throughput scRNA-seq and flow cytometry workflows.
- Standardizes dissociation and isolation steps to maximize reproducibility and quantitative output quality.
- Enables reliable cell-type specific sorting using FACS and reporter mouse lines for assay development.
- Supports scalable adaptation to other fibrotic or aging exocrine tissues with similar dissociation challenges.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling outputs with disease-relevant biomarkers in aged tissue models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional assays on sorted cell populations.
- Reduces biological risk in translational studies by ensuring high cell viability and purity for downstream applications.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust single-cell analysis and targeted cell isolation from challenging aged tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in age-related exocrine gland dysfunction.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity single-cell suspensions for quantitative transcriptomic and cytometric assays.
- Analytics: Provides cell-type resolved molecular data and enables statistical comparison of cellular populations across age groups.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and functional validation in disease-relevant aged tissue models.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse exocrine tissues, supporting platform scalability and cross-program standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-type specific analyses.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of single-cell workflows in aged and fibrotic tissues.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage molecular profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of programs targeting exocrine gland dysfunction and aging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic dissociation, and flow cytometry-based cell sorting.
- Demands access to automated cell counters, FACS instrumentation, and single-cell RNA sequencing platforms.
- Necessitates cross-team standardization of dissociation and sorting protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissues may require optimization of enzyme concentrations and incubation times.
- Cell viability and yield may be limited by tissue fibrosis and cellular fragility in advanced aging models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:36
Lacrimal Gland Tissue Isolation from PdgfraEGFP Transgenic Mouse
1:38
Fragmentation of Harvested Lacrimal Gland Tissue
2:27
Enzymatic Digestion of the Tissue Fragments and Primary Washes
4:30
Accutase and DNase I Treatment
6:33
Results
7:58
Conclusion
