Name: Evaluación de esferoides 3D para estudios de transducción con AAV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprende a evaluar esferoides 3D para estudios de transducción con AAV. Este método permite cuantificar la potencia del vector y la cinética de expresión del transgén en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores agradecen a Morten Seirup y Trish Hoang por proporcionar el plásmido para la producción de nanoluciferasa AAV y los reactivos sustrato vivos. Este proyecto fue apoyado por una designación al Programa de Participación en Investigación de ORISE en el CBER, Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, administrado por el Instituto Oak Ridge para la Educación en Ciencia y Tecnología bajo un acuerdo interinstitucional entre el Departamento de Energía de los Estados Unidos y la FDA.

<ol>
	<li>Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.</li>
	<li>Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.</li>
	<li>Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.</li>
	<li>Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.</li>
	<li>Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.</li>
	<li>Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/.</li>
	<li>Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products.</li>
	<li>Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.</li>
	<li>Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.</li>
	<li>Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.</li>
	<li>Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.</li>
	<li>Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.</li>
	<li>Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.</li>
	<li>Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.</li>
	<li>Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.</li>
	<li>Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.</li>
	<li>Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.</li>
	<li>McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.</li>
	<li>Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.</li>
	<li>Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.</li>
	<li>Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.</li>
	<li>El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.</li>
	<li>Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.</li>
	<li>Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.</li>
	<li>Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.</li>
	<li>Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.</li>
	<li>Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.</li>
	<li>Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos aquí una plataforma 3D in vitro&#160;optimizada para el desarrollo y la evaluación de la potencia de AAV. Esta plataforma aprovecha una transducción mejorada, alta sensibilidad y una mayor predictibilidad translacional mediante el uso de cultivos celulares tridimensionales que se asemejan más estrechamente a la arquitectura del tejido humano. Este sistema logra diferenciar con éxito la eficacia de transducción entre serotipos de AAV y elementos reguladores, incluyendo vectores de cadena sencilla y auto-complementarios, en múltiples líneas celulares. Observamos que, en contraste con los ensayos convencionales en 2D, donde la eficiencia de transducción suele definirse como el porcentaje de células positivas para el transgén, el sistema de esferoides 3D no permite fácilmente la cuantificación con resolución a nivel individual de células. Por lo tanto, en este estudio la eficiencia de transducción se define como la intensidad del señal global del reportero (fluorescente o luminiscente), que refleja las contribuciones combinadas de la proporción de células transducidas y del nivel de expresión del transgén por célula. La alta sensibilidad de los esferoides reduce considerablemente la necesidad de grandes cantidades de producto, lo que la convierte en una herramienta rentable, versátil y fisiológicamente relevante para la investigación y el desarrollo de AAV.
Este enfoque aborda los principales desafíos de los ensayos tradicionales de cultivo celular en 2D, que dependen de la adhesión a superficies artificiales y carecen de organización celular, lo que posiblemente&#160;conduce a predicciones deficientes del rendimiento del vector en entornos clínicos. El sistema de esferoides en 3D imita mejor la estructura del tejido y los patrones de distribución de fármacos, proporcionando datos sobre el comportamiento del vector que se asemejan más a las condiciones biológicas reales22,23. El protocolo utiliza placas sencillas de adherencia ultrabaja, lo que facilita su reproducción en condiciones de laboratorio estándar.
Este sistema adaptable podría utilizarse para ensayos de neutralización de AAV, para estudiar la penetración de AAV y para desarrollar experimentos de co-cultivo más complejos con el fin de investigar los efectos de diferentes entornos celulares sobre la transducción por AAV. Además, plataformas de cribado de fármacos y vectores de alto rendimiento pueden integrarse fácilmente con la plataforma de esferoides, lo que permite la automatización y la reducción de costos en los flujos de trabajo de descubrimiento de vectores para el desarrollo de productos más dirigidos.
Una ventaja práctica importante de los esferoides es su capacidad para crecer continuamente durante semanas sin necesidad de pase celular, lo que permite estudios prolongados de la actividad del AAV. Este sistema de cultivo estable mantiene interacciones importantes entre células y componentes de la matriz, evitando las interrupciones causadas por la recolección repetida de células necesaria en cultivos en 2D24. El entorno celular preservado favorece la organización natural de proteínas y estructuras de membrana que son esenciales para evaluar la unión y entrada del AAV en las células25.
Aunque los esferoides tridimensionales muestran un gran potencial para la evaluación de la transducción por AAV, también presentan algunas limitaciones traslacionales en comparación con modelos in vivo&#160;, principalmente debido a su estructura simplificada en relación con los tejidos nativos. Los esferoides carecen de componentes fisiológicos críticos, incluyendo vasculatura para la administración del vector, células inmunitarias para evaluar la inmunogenicidad y barreras específicas del tejido, como la barrera hematoencefálica, que podrían afectar significativamente el desempeño del AAV26. Estas limitaciones indican que los esferoides, a pesar de ofrecer un nivel intermedio de complejidad entre los cultivos convencionales en 2D y los modelos animales in vivo, siguen siendo insuficientes para recapitular completamente el microentorno fisiológico necesario para una evaluación exhaustiva del AAV.
El protocolo de esferoides presentado aquí describe un solo tipo celular a la vez. Este protocolo puede desarrollarse para incluir de 2 a 3 tipos celulares adicionales que se agregan en una estructura tridimensional básica. Los modelos 3D más complejos, como los organoides o la microfluídica, son sistemas multicelulares que recapitulan la diversidad celular y la organización de órganos específicos, conteniendo 10 o más tipos celulares distintos dispuestos en patrones similares a los de tejidos. Dichos organoides 3D avanzados pueden incluir múltiples células27, cultivos embebidos en hidrogel, técnicas de gota colgante y plataformas microfluídicas11,27,28. Aunque estos métodos proporcionan una arquitectura tisular más compleja que podría ayudar a profundizar en el conocimiento de la biología de los AAV, suelen requerir reactivos y equipos más especializados, así como una considerable experiencia técnica. Por otro lado, los esferoides 3D formados en placas de adherencia ultra baja son considerablemente más sencillos y adecuados para muchos laboratorios debido a su bajo costo y reproducibilidad.
Los pasos críticos para la implementación exitosa de este protocolo incluyen mantener una viabilidad celular alta, ya que las células comprometidas pueden afectar negativamente la formación de esferoides y la eficiencia de transducción. El uso de placas con adherencia ultrabaja y la optimización de la centrifugación también son fundamentales para lograr una compactación adecuada de los esferoides. Es esencial optimizar la MOI para cada tipo celular y serotipo de AAV con el fin de evitar señales débiles o saturación. La selección del método de detección adecuado también es crítica, particularmente para análisis cinéticos, donde se requiere compatibilidad con sistemas de imágenes continuas en células vivas. Varias consideraciones técnicas son importantes para la interpretación precisa de la transducción por AAV en esferoides tridimensionales.
Una señal de transducción débil o ausente puede deberse a una titulación viral baja, una MOI subóptima o un tiempo de incubación insuficiente; esto puede resolverse verificando los títulos virales, optimizando la MOI y prolongando el tiempo de incubación (típicamente de 3 a 5 días). Señales débiles de fluorescencia o luminiscencia pueden reflejar una baja expresión del transgén o una penetración limitada del reactivo dentro de la estructura tridimensional, lo cual puede mejorarse optimizando los ajustes de exposición o permitiendo tiempo adicional para la difusión del sustrato. Un desafío importante en ciertas líneas celulares, como las células HeLa, es la autofluorescencia, que puede provocar una señal de fondo elevada y una sensibilidad reducida en ensayos basados en fluorescencia. Para abordar esta limitación, implementamos un sistema de reportero basado en nanoluciferasa con luminiscencia, que proporciona una relación señal-ruido mejorada y permite una detección más precisa de la transducción en fondos autofluorescentes. Además, la señal de fondo puede originarse por umbralización inadecuada o por fluorescencia relacionada con el medio, y debe controlarse mediante pozos no tratados (MOI = 0) para definir los niveles basales. Finalmente, la saturación de la señal a altas MOI puede ocurrir debido a una entrada viral excesiva o a limitaciones del detector; esto puede mitigarse reduciendo el rango de MOI y optimizando los ajustes de exposición del detector para mantener las mediciones dentro del rango dinámico lineal.
En general, esta metodología de esferoides tridimensionales proporciona un sistema optimizado y reproducible para evaluar la transducción, potencia y cinética de los AAV. Al cerrar la brecha entre los ensayos convencionales en 2D y los estudios in vivo, permite un desarrollo de vectores más informado y apoya el avance de estrategias de terapia génica clínicamente relevantes.

Los vectores de AAV se han convertido en uno de los sistemas preferidos de entrega génica para aplicaciones in vivo debido a su perfil de seguridad y su capacidad para lograr una expresión génica persistente1. La terapia génica con AAV está mostrando éxito en el tratamiento de múltiples indicaciones de enfermedades raras, con cientos de productos en la fase de desarrollo2. Además, las aplicaciones emergentes incluyen la entrega in vivo de componentes de edición del genoma, como Cas9, con un gran potencial para ayudar en el tratamiento de indicaciones difíciles de tratar3. Los desafíos clave en el desarrollo incluyen los altos costos de fabricación y la capacidad limitada de predicción de los ensayos in vitro actuales para determinar la calidad del producto y la eficacia clínica4.
El avance de los tratamientos con AAV está fundamentalmente limitado por la falta de ensayos de actividad estandarizados y predictivos que puedan predecir con precisión el rendimiento clínico4,5. Estos ensayos son un componente crítico del proceso de desarrollo, ya que se utilizan con múltiples fines, incluyendo el cribado de bibliotecas de vectores modificados, la optimización de modificaciones del capside para mejorar el direccionamiento y la evaluación del tropismo tisular específico. También sirven para caracterizar la influencia de las secuencias reguladoras en la expresión del transgén6. Más allá de la selección de candidatos, los ensayos de transducción con AAV también apoyan el control de calidad crítico en la fabricación mediante ensayos de potencia utilizados para la liberación de lotes, estudios de comparabilidad entre lotes y evaluaciones de estabilidad6,7.
El desafío científico consiste en desarrollar ensayos que capturen la complejidad de las interacciones vector-huésped manteniendo al mismo tiempo la viabilidad práctica para su uso rutinario7,8. Los enfoques actuales incluyen el uso de líneas celulares inmortalizadas que representan el órgano diana en cultivos tradicionales en monocapa bidimensional. Estas condiciones de cultivo carecen de relevancia fisiológica y requieren dosis elevadas de fármacos. Esto genera una brecha significativa entre las predicciones de laboratorio y la transladabilidad clínica. Las líneas celulares modificadas novedosas, como los sistemas con sobreexpresión de AAVR o activados mediante CRISPR, representan avances importantes, pero no logran reproducir la arquitectura tridimensional ni las interacciones con la matriz extracelular características de los tejidos nativos9,10,11. Los modelos de nueva generación que simulen mejor los microentornos in vivo podrían cerrar esta brecha translacional12,13,14.
Recientemente desarrollamos un sistema de esferoides tridimensionales optimizado para la transducción con AAV, con el fin de mejorar la trasladabilidad de los ensayos de transducción con AAV. Este sistema mejora significativamente la eficiencia de transducción con AAV en múltiples líneas celulares y serotipos de AAV en comparación con los ensayos bidimensionales considerados estándar de oro. Además de la mayor sensibilidad y conservación del producto utilizado en el ensayo, estos modelos superan a las monocapas bidimensionales al proporcionar interacciones realistas entre células que varían según la ubicación celular dentro del esferoide. Asimismo, permiten investigar de forma significativa la penetración de fármacos, simulando condiciones reales de los órganos11,15,16. Además, este enfoque con esferoides ofrece ventajas prácticas frente a sistemas más complejos, como organoides o cultivos mixtos, ya que utiliza equipos de laboratorio estándar y evita la necesidad de medios especializados o andamios. Esta simplicidad garantiza la reproducibilidad y escalabilidad, lo que lo hace especialmente adecuado para pruebas rutinarias de terapia génica y para flujos de trabajo en el desarrollo de vectores17.
Esta plataforma de esferoides tridimensionales es particularmente adecuada para aplicaciones que requieren detección sensible de la transducción por AAV a bajas dosis y evaluación comparativa de diseños de genomas virales. También permite la evaluación del tropismo dependiente del serotipo. Es especialmente ventajosa para líneas celulares con eficiencia de transducción relativamente baja, que requieren altas dosis de AAV en cultivos convencionales en 2D. En estos contextos, la mayor sensibilidad y la mejor relevancia fisiológica de la plataforma 3D son fundamentales. Sin embargo, este sistema podría ser menos apropiado para estudios que requieran componentes inmunitarios, administración vascular o complejidad tisular completa. Esto se debe a que los esferoides no recapitulan completamente el entorno in vivo&#160;.
Por lo tanto, presentamos un protocolo sencillo de esferoides tridimensionales optimizado para ensayos de transducción con AAV, con dos lecturas críticas y complementarias: eficiencia de transducción (definida aquí como la señal total del marcador por esferoide) y cinética de transducción. Este método proporciona una plataforma rentable, fisiológicamente relevante e informativa para la evaluación de la potencia de AAV, el diseño de vectores y los ensayos de neutralización.

<table><tbody><tr><td>Incubadora a 37 °C</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#51025983</td><td>Condiciones estándar de cultivo</td></tr><tr><td>Células A375</td><td>ATCC</td><td>CRL-1619</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Plásmido AAV1</td><td>Addgene</td><td>112862</td><td>Plásmido AAV</td></tr><tr><td>Plásmido AAV2</td><td>Addgene</td><td>104963</td><td>Plásmido AAV</td></tr><tr><td>Plásmido AAV5</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td>Plásmido AAV</td></tr><tr><td>Plásmido AAV8</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td>Plásmido AAV</td></tr><tr><td>Plásmido AAV9</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>Plásmido AAV</td></tr><tr><td>Lector de placas BioTek GEN5</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>Lectura final para fluorescencia o luminiscencia</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#TSO-MX1R</td><td>Mantener la suspensión de esferoides</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato para cultivo celular Corning&amp;trade; (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MT21040CMX</td><td>PBS para lavar las células</td></tr><tr><td>DMEM con alta glucosa, suplemento GlutaMAX y piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#10569010</td><td>Medio de crecimiento completo</td></tr><tr><td>Inhibidor extracelular de NanoLuc&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N235B</td><td>Apaga cualquier señal de Nanoluc&amp;reg; proveniente del entorno extracelular&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F4135-500mL</td><td>Proporcionar factores de crecimiento</td></tr><tr><td>Células HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Células HEP3B</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Células HEPG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Células Huh7</td><td>ABM</td><td>T8973</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Microscopio invertido IncuCyte S3</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>Monitorear la formación y el crecimiento de esferoides</td></tr><tr><td>Imagen de IVIS Spectrum</td><td>Spectralinvivo</td><td>NA</td><td>Lectura final para luminiscencia</td></tr><tr><td>Ensayo Nano-Glo&amp;reg; para células vivas&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2013</td><td>Reactivo sustrato luminiscente para detección en células vivas</td></tr><tr><td>Penicilina-Estrepotomicina (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td>Prevenir contaminación bacteriana</td></tr><tr><td>Frascos de cultivo de tejidos T75 con ventilación</td><td>Fisher Scientific</td><td>#NC0509296&amp;nbsp;</td><td>Frascos para cultivar células</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05 %)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25300120</td><td>Desprendimiento enzimático de células</td></tr><tr><td>Placas con baja adhesión</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>Evitar la adhesión celular para promover la formación de esferoides</td></tr></tbody></table>

evaluación de esferoides 3d para estudios de transducción con aav

Evaluation of 3D Spheroids for AAV Transduction Studies

Los virus adenoasociados (AAV) son vectores potentes utilizados para la entrega génica en productos de terapia génica. Su desarrollo requiere sistemas in vitro&#160; que puedan detectar de manera confiable diferencias en el diseño del vector, el desempeño del serotipo, la fuerza de los elementos reguladores y la cinética de expresión. Estos sistemas también deben permitir aplicaciones como la evaluación de la potencia y la optimización del vector. Aquí describimos una plataforma optimizada en tres dimensiones basada en esferoides, diseñada para evaluar la potencia de los AAV, la cinética de expresión del transgén y la eficacia de transducción específica por serotipo en diversas líneas celulares. Los esferoides uniformes se generan utilizando placas con adherencia ultrabaja y se mantienen en condiciones que favorecen una arquitectura estable y un imagenado a largo plazo. Tras la transducción con AAV, las señales fluorescentes o luminiscentes se monitorean en tiempo real mediante sistemas de imagenado de células vivas. Esto permite la evaluación cuantitativa de la señal del reportero, la respuesta a la dosis, la actividad de los elementos reguladores y el tiempo de inicio mediante imagenado cinético continuo. La plataforma discrimina eficazmente entre diseños de genoma vectorial potentes y débiles, así como entre múltiples serotipos de AAV. Este método demuestra un desempeño robusto tanto en líneas celulares de división lenta como rápida. Estos resultados establecen su utilidad como un sistema escalable y fisiológicamente relevante para la evaluación y el desarrollo preclínicos de terapias génicas.

Los sistemas de cultivo de esferoides tridimensionales mejoran los modelos convencionales en 2D para el desarrollo de la terapia génica con AAV. Esta metodología permite la detección sensible de la transducción por AAV a bajas dosis, una mayor relevancia fisiológica y un monitoreo robusto a largo plazo. La plataforma facilita la evaluación de potencia, el cribado de alto rendimiento y la optimización de vectores en diversas líneas celulares y serotipos de AAV.

Evaluación de esferoides 3D para estudios de transducción con AAV

Los virus adenoasociados (AAV) son vectores potentes utilizados para la transferencia de genes en productos de terapia génica. Su desarrollo requiere sistemas in vitro que...

Desarrollamos una plataforma sensible y fisiológicamente relevante de esferoides tridimensionales para evaluar la actividad de transducción de AAV y mejorar la predicción del rendimiento del vector para la terapia génica. Este protocolo es aplicable para evaluar la actividad de AAV en pruebas de potencia del vector, cribado de serotipos, optimización del transgén, estudios de neutralización y terapia génica preclínica in vitro.Para comenzar, cultive las células en un matraz para cultivo celular T75 hasta que alcancen una confluencia del 70 % en condiciones estándar. Después de la tripsinización, prepare una dilución de 1 a 10 para el paso rutinario de células. Incube nuevamente las células hasta que alcancen una confluencia del 70 %, luego recójalas. Tras evaluar la viabilidad celular, pipetee cuidadosamente la suspensión celular para asegurar una mezcla homogénea. Realice diluciones seriadas al doble en una placa de 96 pocillos con adherencia ultrabaja, comenzando con 1 × 10⁴ células por pocillo en 200 µL. Siguiendo el diseño experimental mostrado, agregue 1 volumen de medio completo a todas las filas excepto a la fila superior. Luego agregue 2 volúmenes de 1 × 10⁴ células por pocillo en la fila superior. Diluya seriadamente la fila 1A añadiendo 1 volumen de la fila 1A a la fila 1B, y continúe de la misma manera. Centrifugue la placa de adherencia ultrabaja a 350 × g durante cinco minutos para concentrar las células en el centro y promover el contacto célula a célula. Incube a 37 °C, sin perturbar, durante 24 a 48 horas para la formación de esferoides. Permita tres días para que el diámetro alcance aproximadamente 400 µm. Verifique la uniformidad del tamaño de los esferoides, asegurándose de que las células estén resuspendidas de manera uniforme y de que las placas estén niveladas. Monitoree la morfología de los esferoides. Seleccione esferoides maduros que presenten una adhesión celular estrecha en lugar de agregados celulares sueltos.Una vez que las suspensiones celulares hayan sido centrifugadas, transfiera la placa a un incubador a 37 grados Celsius equipado con un instrumento de imagen en tiempo real para células vivas. Inicie sesión en el software de adquisición. Seleccione Programar para adquirir y Escanear según programación, luego seleccione Crear recipiente como Nuevo. A continuación, elija el tipo de escaneo y seleccione esferoide. Elija los canales de interés. Seleccione fase con campo brillante. Luego elija verde o rojo. Establezca la ampliación deseada en 10x. Seleccione el modelo de placa y su posición en el cajón. Elija los pocillos a imaginar e ingrese el nombre del experimento. Para la configuración del análisis, seleccione Differ analysis para más adelante. Configure los escaneos para que se agreguen cada seis horas y escanee indefinidamente. Revise diariamente el crecimiento de los esferoides iniciando sesión en el software de imagen. Seleccione Ver escaneos recientes y haga doble clic en el experimento deseado. Después de seleccionar Campo brillante en el panel de canales de imagen, utilice la función Medir imagen para medir los diámetros de los esferoides. Retire la placa el día de la formación óptima de esferoides y úsela para la transducción con virus asociado a adenovirus, o AAV.Prepare una placa de 96 pocillos de fondo redondo que contenga 297 microlitros de DMEM suplementado con 2% de FBS y sin antibióticos. Añada 33 microlitros de stock de AAV al medio para obtener una multiplicidad de infección inicial, o MOI, de 1 × 10⁶. Luego prepare diluciones seriadas de 10 veces transfiriendo 33 microlitros de cada dilución a 297 microlitros de medio. Aspire todo el medio de la placa de esferoides previamente preparada utilizando una pipeta multicanal. Transfiera 100 microlitros del MOI deseado de AAV desde la placa de dilución a la placa de tratamiento usando una pipeta multicanal. Vuelva a colocar las placas en el instrumento de imagen. Comience a monitorear la transducción mediante el seguimiento de la intensidad fluorescente verde durante 72 horas. Añada 100 microlitros de DMEM completo por pocillo cada tres días para reponer los nutrientes. Vuelva a colocar la placa en el instrumento de imagen y comience a registrar la eficiencia de transducción cada seis horas. Analice los datos creando una definición de análisis específica para las células y los genes reporteros de interés. Realice un análisis de punto final utilizando lecturas de fluorescencia. De manera similar, realice la transducción con AAV en esferoides 3D que contengan reporteros luminiscentes, seguido del análisis de transducción mediante imagen bioluminiscente.Cada línea celular exhibió características morfológicas distintas y niveles variables de compactación tras tres días de siembra. Las líneas celulares hepáticas formaron esferoides más compactos y densos que las otras líneas celulares. HEK293T formó una apariencia esférica muy redonda con un núcleo necrótico bien definido. A375 formó un agregado celular de forma irregular. Los esferoides fueron altamente susceptibles a la transducción con AAV, detectándose una transducción fuerte a títulos muy bajos de AAV en diferentes líneas celulares para GFP auto-complementario. La transducción de GFP de cadena sencilla en esferoides se observó a niveles más bajos que la de GFP auto-complementario. Se observó una diferencia de 100 veces en la fluorescencia relativa entre los transgenes auto-complementarios y de cadena sencilla a una MOI de 10 a la potencia de 6 en células HEK293T. Se observó una diferencia de tres veces en la fluorescencia relativa entre los transgenes auto-complementarios y de cadena sencilla en células HEP3B. Los cuatro serotipos de AAV se detectaron con éxito mediante el lector de placas fluorescente y el sistema de imagen en células vivas. AAV2 mostró la mayor eficacia de transducción, seguido por AAV1 en ambas líneas celulares. Todos los serotipos de AAV mostraron una transducción eficiente utilizando el sistema luminiscente, lo que permitió una diferenciación precisa de la eficacia de transducción. AAV2 fue el serotipo más eficaz en esferoides de HeLa, mientras que AAV9 presentó la menor eficacia de transducción. La transducción de GFP auto-complementario con AAV2 fue detectable a tasas de infección tan bajas como 10 a la potencia de 1, con un aumento notable de la señal tras aproximadamente 34 horas en comparación con células no tratadas. La señal de GFP de cadena sencilla con AAV2 fue más débil y más lenta que la señal de GFP auto-complementario.El desafío principal al realizar este protocolo consiste en mantener una viabilidad celular alta, producir esferoides uniformes y compactos, y optimizar la dosificación de AAV para cada tipo celular y serotipo. Este protocolo puede evaluar la expresión y funcionalidad del transgén mediante RT-qPCR, inmunotransferencia Western, ELISA y ensayos de actividad somática, así como análisis cinéticos del tiempo de inicio. En estudios futuros se podrán incorporar cultivos celulares mixtos, organoides, microfluídica, células inmunitarias o vasculatura para imitar mejor el microentorno in vivo.

evaluation-of-3d-spheroids-for-aav-transduction-studies

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe la identificación del serotipo del virus adeno-asociado 3 (AAV3) como el vector más eficiente para orientar las células humanas del cáncer de hígado.

De alta eficiencia de transducción de las células de cáncer de hígado por recombinante serotipo del virus adeno-asociado 3 Vectores

Se demuestra la técnica básica para diseñar y evolucionar molecularmente sintéticos virales adeno-asociados (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia de ADN arrastrando los pies. Por otra parte, nos proporcionan las pautas generales y ejemplos representativos para la selección y el análisis de cada uno de cápsidas quiméricas con propiedades mejoradas en las células diana en la cultura o en ratones.

Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN

Para investigar la permeabilidad de la barrera hematorretiniana y la integridad de la membrana limitante interna en modelos animales de enfermedad de la retina, utilizamos varias variantes de virus adenoasociados (AAV) como herramientas para etiquetar las neuronas de la retina y la glía. La expresión génica reportera mediada por virus se utiliza como indicador de la permeabilidad de la barrera retiniana.

Utilizando adeno-asociado virus como una herramienta para estudiar las barreras de retina en la enfermedad

Aquí, describimos una estrategia eficiente y reproducible para producir, título y lotes de control de calidad de vectores de virus adeno-asociado. Permite al usuario obtener una preparación de vector con alto título (≥1 x 1013 vector genomas/mL) y una alta pureza, para uso en vitro o en vivo .

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Este método se puede utilizar para examinar el acortamiento del sarcómero usando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes.

Sarcómero acortamiento De Cardiomiocitos Derivados De Células Madre Pluripotentes Usando Proteínas De Sarcómero Marcado Con Fluorescentes.

El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Aquí, se presenta un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que resulta en una reducción del tiempo y la mano de obra necesarios para la producción de vectores utilizando componentes que están disponibles para fines de investigación de proveedores comerciales.

Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la generación y purificación de vectores virales adenoasociados utilizando un método optimizado de cromatografía de afinidad basado en heparina. Presenta un enfoque simple, escalable y rentable, que elimina la necesidad de ultracentrifugación. Los vectores resultantes exhiben una alta pureza y actividad biológica, lo que demuestra su valor en estudios preclínicos.

Aislamiento de vectores virales adenoasociados mediante un protocolo de cromatografía de afinidad con heparina semiautomatizado y de un solo paso

Aquí detallamos un protocolo optimizado para la inyección de venas laterales de cola en ratones para administrar sistémicamente virus adenoasociados (AAV) en ratones adultos. Además, describimos los protocolos de los ensayos comúnmente utilizados para evaluar la transducción de AAV.

Liberación consistente de virus adenoasociados a través de la inyección lateral de la vena de la cola en ratones adultos

Este informe detalla el método de inyección localizada de vectores AAV a través de la pelvis renal para una transferencia de genes efectiva y segura al riñón del ratón.

Entrega efectiva y segura de genes al riñón de ratón mediante inyección lenta retrógrada en la pelvis renal de vectores de virus adenoasociados

Aprende a evaluar esferoides 3D para estudios de transducción con AAV. Este método permite cuantificar la potencia del vector y la cinética de expresión del transgén en tiempo real.

Evaluación de esferoides 3D para estudios de transducción con AAV

Explorar más videos