Reprogramación de líneas de células madre pluripotentes inducidas a partir de muestras congeladas de capa buffy

El propósito de este protocolo es reprogramar los abrigos buffy congelados humanos o PBMCs en células madre pluripotentes inducidas. Este protocolo purifica de forma única los pelajes color beige tras el descongelamiento e identifica una morfología celular somática que indica el éxito de la reprogramación. Para empezar, recupera el abrigo buffy congelado derivado de sangre humana y colócalo sobre hielo.

Gira suavemente la muestra en un baño María a 37 grados Celsius y retira el frasco cuando solo quede un pequeño cristal de hielo. Transfiera cuidadosamente el contenido del vial gota a gota a un tubo cónico que contenga 12 mililitros de DPBS. Enjuaga el vial con un mililitro de DPBS y añade el enjuague al tubo cónico que contiene las células extraídas.

Centrifuga la muestra usando un rotor de cubo oscilante a 200 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Retira cuidadosamente el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet celular en cuatro mililitros de DPBS que contienen un 1% de FBS. A continuación, se superpone suavemente la mezcla de capa buffy sobre tres mililitros de solución de gradiente de densidad, evitando mezclarse en la interfaz.

Centrifugar usando un rotor de cubeta oscilante a 800 g durante 20 minutos a temperatura ambiente con el freno desactivado. Usando una pipeta, retira y descarta la capa superior de plasma sin alterar el plasma a la interfaz de gradiente. Después, retira la célula mononuclear periférica de la sangre, o capa PBMC, en la interfaz y transfiere a un tubo limpio de 15 mililitros.

Lava los PBMC añadiendo tres mililitros de medio de expansión y centrifugando a 200 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en dos mililitros de medio de expansión que contenga citocinas como SCF, IL-3, EPO e IGF-1. Placar las celdas en un pozo de una placa de 12 pozos.

Cultiva las células a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono y un 20% de oxígeno durante 10 a 14 días. Reemplazar la mitad del medio día sí y día no hasta observar una población densa de eritroblastos brillantes y redondos, lo que indica que las células están listas para la transducción. Tres días después de la transducción con el virus Sendai que transporta los factores Yamanaka, se placan las células sobre fibroblastos embrionarios de ratón a dos mililitros por pozo.

Incubar los cultivos durante unos siete días, alimentando a las colonias emergentes con medios hESC cada dos días. Colocar la placa que contiene las células transducidas y las colonias emergidas bajo un microscopio disecante. Utiliza el microscopio para localizar una colonia y levantar la tapa de la placa para exponer el pozo.

Abre la jeringuilla asépticamente y expone la aguja. Guiados por el microscopio, utiliza la punta de la aguja para separar la colonia de las células alimentarias circundantes trazando el contorno de la colonia. Usa la punta de la aguja para cortar la colonia en varios trozos de tamaño igual.

Si las piezas no se han desprendido, usa el lateral de la aguja para recogerlas o rasparlas de la placa hasta que floten. Ahora, usando una pipeta P200, localiza la colonia seleccionada bajo el microscopio, aspira la colonia flotante con la pipeta y transfierela a un pozo de la placa preparada de 24 pozos. Asegúrate de que toda la colonia se transfiera sin recoger otras colonias o células alimentadoras.

Colocar la placa en la incubadora a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono y un 20% de oxígeno hasta alcanzar la confluencia deseada. Identifica las colonias grandes, redondas y con bordes brillantes como listas para partirse. Aspira el medio del pozo y enjuaga la muestra una vez con un mililitro de DPBS.

Luego retira el DPBS y añade 500 microlitros de buffer de disociación EDTA de 0,5 milimolares. Incuba la muestra a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante dos minutos hasta que las colonias se aflojen y las células se redondeen. A continuación, retira la placa de la incubadora y aspira el buffer de disociación de EDTA.

Usando una pipeta P1000, recoge las células con un mililitro de medio multipotente humano pipeteando suavemente arriba y abajo hasta que las colonias se desprendan y se fragmenten ligeramente. Transfiere el mililitro de medio y las células a una nueva placa de seis pozos que contenga un mililitro de medio fresco pluripotente de células madre humanas. Coloca las células en la incubadora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y 20% de oxígeno.

Alimenta diariamente con células madre pluripotentes inducidas hasta que el pozo esté confluiente y listo para dividirse. Mientras tanto, cubre un recipiente de 10 centímetros con 7 mililitros de una solución de vitronectina de cinco microgramos por mililitro preparada en DPBS y déjalo incubar a temperatura ambiente durante una hora. Para continuar la división, añadir entre 7 y 10 mililitros de medio pluripotente humano a la placa de 10 centímetros y transferir las células de la placa de seis pozos a la placa en una proporción 1:1, incubándola como se ha demostrado anteriormente.

Confirma que las células en el plato de 10 centímetros están confluyentes antes de volver a dividirlas. Ajusta la razón de división según la morfología y densidad celular, normalmente usando una relación 1:10, y anota el número de pasajes en cada pasaje. Finalmente, caracterizar las células madre pluripotentes inducidas confirmando la expresión del marcador de stemness NANOG mediante inmunofluorescencia.

Diferenciar las células en linajes ectodermos, mesodermos y endodermos usando condiciones de cultivo definidas. Evalúa el potencial de diferenciación mediante tinción para PAX6, Brachyury y SOX17, junto con la pérdida de expresión de NANIG. Al final de la expansión, los PBMC se diferenciaron en eritroblastos que aparecían como células brillantes y redondas de tamaño grande y pequeño.

Mientras que los cultivos que carecían de estas células o que parecían muertos tenían pocas probabilidades de reprogramarse con éxito. La transducción y reprogramación exitosas se caracterizaron por la aparición de colonias de células madre pluripotentes inducidas en células alimentadoras irradiadas, que luego desarrollaron la morfología típica de las células madre. Mientras que las células que no adoptaron morfología similar a la de las células madre no fueron reprogramadas con éxito.

Las células madre pluripotentes inducidas reprogramadas con éxito mostraron colonias densas y redondas con bordes lisos y brillantes. Los subclones con morfología menos ideal, como la diferenciación espontánea o centros densos, se limpiaron ajustando las condiciones de escissió. Algunas colonias seleccionadas no lograron expandirse con éxito.

Además de la morfología, las células madre pluripotentes inducidas exhibieron formación tallo, como lo demuestra la expresión del marcador de tallo NANOG. Las células madre pluripotentes inducidas reprogramadas demostraron potencial de diferenciación en ectodermo, mesodermo y endodermo. Este protocolo proporciona puntos de control detallados para rastrear y predecir el éxito de la reprogramación.

Para confirmar aún más que una línea de iPSC es adecuada para su uso, se deben realizar cariotipados, genotipado y pruebas regulares de micoplasma. Este protocolo permite reprogramar a partir de poblaciones de pacientes existentes con capas buffy biobankadas, ampliando la utilidad de la tecnología iPSC.