Uso de RMN en solución para caracterizar condensados biomoleculares bajo condiciones bifásicas

Desarrollamos métodos de RMN para estudiar condensados biomoleculares. Estos son clave para la gestión celular, pero su información siempre está implícita en múltiples trastornos. Utilizando nuestros métodos, investigamos las propiedades del material condensado, analizamos el mecanismo de su formación y monitorizamos cambios a largo plazo como la maduración del condensado o la fibrilación patológica de biomoléculas.

Para empezar, preparar la muestra bifásica final estabilizada con hidrogel de agarosa mezclando las reservas de proteínas, reservas de ARN o ambas con el respectivo buffer de agarosa tibio en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. La concentración final de proteína, o ARN, suele ser de 50 a 500 micromolares para la detección de RMN. Inserta la muestra bifásica preparada en un espectrómetro, luego bloquea, shim, empareja y ajusta el canal de protones como de costumbre.

Calibra la longitud de pulso de 90 grados en el canal de protones usando el procedimiento general de calibración. Luego graba un espectro unidimensional con agua suprimida y comprueba si el espectro contiene señales biomoleculares fuertes. Si no se observa señal o muy poca, no continúes con REDIFINE, sino que utilices el CONDENSE-MT.

Registrar un experimento de espectroscopía ordenada por difusión para calcular la intensidad del gradiente de difusión del 2 al 95% en 16 pasos lineales. Para seguir adquiriendo datos para el conjunto completo de REDIFINE, crear nueve nuevos experimentos PPP GPQ S19 copiando los parámetros del experimento inicial que acaba de realizarse. En cada experimento consecutivo, cambiar solo el retardo de difusión D20 en pasos variables para abarcar el rango de 100 a 1000 milisegundos.

Ejecuta cada uno de estos experimentos con el comando adecuado. Utiliza la última N para preservar la ganancia del receptor durante los 10 experimentos. Establece Q Sign con SSB2 como función de ventana.

Luego extrae la quinta porción usando el comando correspondiente. Fasea el espectro unidimensional y guarda los parámetros de fase en el conjunto de datos bidimensional. Procesar el conjunto de datos bidimensional con el XF2 y realizar la corrección de línea base con ABS2.

Después de eso, extrae las 16 rodajas con 2D dividido. Repite el procedimiento similar para los nueve experimentos restantes. Revisa al menos las primeras cuatro o cinco rebanadas para asegurarte de que la fase y la corrección de línea base son correctas.

Si es necesario, corregir manualmente la fase y la línea base. Luego utiliza el código MATLAB adecuado para el análisis. En el código, modifica los tiempos de difusión, establece los valores de PG según la intensidad del gradiente de la sonda y asigna los experimentos del uno al diez según el número total de experimentos.

Luego ajusta los datos según el modelo REDIFINE usando este código. Graba el espectro 1D con agua suprimida. Si se observa muy poca señal, proceda con el experimento CONDENSE-MT.

Determina la tasa R1 del agua por recuperación de inversión T1 para CONDENSE-MT cuantitativo. Copia la secuencia de pulsos y la lista de VD proporcionadas a las carpetas correspondientes. Tras calibrar el pulso de 90 grados del protón, ajusta NS a 2, DS a 0, D1 a 20 segundos y SW a 10 partes por millón.

TD2 a 16.000 y TD1 a 24. Para el experimento CONDENSE-MT, copia el conjunto de parámetros de Bruker, la secuencia y la lista de frecuencia proporcionados a las carpetas específicas de Bruker. Luego ajusta las frecuencias y la potencia según el espectrómetro.

Ajuste P1 a la longitud calibrada del pulso de 90 grados y P4 a un microsegundo para el pulso de excitación para evitar la amortiguación de radiación. Configura NS a 2, DS a 16, D1 a cuatro segundos, SW2 a 20 partes por millón, TD2 a 8k y TD1 a la longitud de la lista de frecuencias. Ponle SPNAM10 a Squa100.000 y P10 a cinco segundos.

Encuentra la potencia SP10 que produce irradiaciones de 100 hercios. Ajusta la potencia SP10 del pulso de irradiación en consecuencia. Ejecuta el experimento pseudo bidimensional con el comando adecuado y monta una serie de estos experimentos pseudo 2D, variando las potencias de irradiación SP10.

Después de ajustar todos los parámetros, ejecuta el código para leer los espectros de RMN, que integran la señal de agua y la guardan en una nueva variable. En la recuperación por inversión de código, ajusta la ruta a los datos apropiados y comprueba la región de integración de agua. Luego ajusta el número del experimento que contiene los datos de recuperación por inversión.

Establezca todos los parámetros experimentales e introduzca los valores del pool vacío de agarosa obtenidos previamente ajustando el conjunto de datos de agarosa de manera similar. Ejecuta la primera sección del código condensado vacío para obtener el ajuste para la relajación longitudinal del agua. Luego ejecuta la sección de ajuste vacío condensado para iniciar la figura en vivo que muestra la minimización de la función de ajuste.

Ejecuta la siguiente sección del código para determinar las incertidumbres y graficar los datos. El ajuste REDIFINE determinó los coeficientes de difusión en las fases diluida y condensada, la población de proteína en la fase condensada, el tamaño medio de las gotas y la permeabilidad de interfase para la muestra del dominio FUS N-terminal. La señal RMN del dominio FUS N-terminal permaneció detectable en la fase condensada.

No se observó ninguna diferencia en el perfil de transferencia de magnetización entre la referencia de agarosa y el dominio N-terminal FUS por muestra fásica. Para condensados de ARN repetidos en CAG, no se observa señal de RMN. Por tanto, el perfil de transferencia de magnetización es significativamente diferente de la referencia de agarosa.

El experimento CONDENSE-MT proporcionó caracterización dinámica de condensados de ARN de expansión repetida. El análisis CONDENSE-MT reveló la cinética de intercambio de protones entre el condensado y el agua a granel. El análisis CONDENSE-MT también proporcionó el tiempo de relajación transversal del ARN en el condensado y la aparente tasa de relajación transversal del agua a granel.

En este protocolo, podemos caracterizar la propiedad del condensado en estado bifásico sin necesidad de una etiqueta química. Las gotas coexisten con un entorno diluido, permitiendo el intercambio entre las dos fases que imitan el entorno celular. Nuestros métodos centrados en la caracterización de condensados pueden complementarse con métodos convencionales de RMN para estudiar las interacciones y dinámicas de la estructura molecular a través de fases.

En futuros estudios, nuestro objetivo es desarrollar modelos de condensados más complejos, adaptando la metodología a sistemas más complejos y, eventualmente, estudiar el condensado directamente en sus entornos celulares.