Extracción de ADN en columna de rendimiento medio usando racks de 24 pozos

Nuestra investigación se centra en pistas impresas en 3D para la extracción paralela de ADN y ARN mediante columnas de centrifugación, creando un puente entre los métodos manuales y automatizados. Este artículo aborda las limitaciones de los métodos manuales con columnas de centrifugación, que requieren mucha mano de obra, al permitir el procesamiento simultáneo de hasta 116 muestras de ADN o ARN. Para comenzar, utilice una impresora 3D de filamento fusionado con una boquilla de 0,4 milímetros para imprimir el soporte.

Utilice un filamento genérico de polilactida, o PLA, tereftalato de polietileno y glicol, o PETG, o acrilonitrilo butadieno estireno, o ABS, con relleno del 100 %. Establezca la altura de capa en 0,1 milímetro y active el alisado de superficie. Ajuste la configuración de impresión para garantizar la estanqueidad al agua y la estabilidad mecánica.

Pruebe los estantes para verificar su impermeabilidad antes de usarlos por primera vez. Llene el depósito impreso con etanol al 70 % para probarlo antes del uso. Centrifugue durante períodos progresivamente crecientes para confirmar la ausencia de fugas o daños estructurales.

Después de realizar con éxito la prueba utilizando pegamento, una los componentes del depósito base para formar una unidad sellada. Inocule Escherichia coli, o transformantes E. coli, en tres a cinco mililitros de caldo de lisogenia, o medio LB, que contenga los antibióticos adecuados. Incube el cultivo durante 12 a 16 horas a 37 grados Celsius con agitación.

Centrifugar a 2000 G durante 10 minutos para recoger las células. Desechar el sobrenadante. Añadir 250 microlitros de tampón de resuspensión al precipitado.

Y resuspenda completamente el precipitado mediante vortex o pipeteo. Añada 250 microlitros de tampón de lisis. Y mezcle suavemente invirtiendo el tubo de cuatro a seis veces o agitando suavemente la placa de 24 pocillos.

Añada 350 microlitros de tampón de neutralización y mezcle. Observe la formación de un precipitado blanco para confirmar la neutralización exitosa. Añada tampón de lisis a un tubo que contenga polvo de dióxido de titanio.

Añada una relación de volumen a masa de dos a uno. Añada 250 microlitros de la suspensión de dióxido de titanio al lisado y mezcle agitando el tubo.

Añada 350 microlitros de tampón de neutralización y mezcle completamente. Centrifugue a 2000 G durante 10 minutos. Observe el botón celular completamente precipitado en presencia de dióxido de titanio y el sobrenadante completamente transparente.

En ausencia de dióxido de titanio, observe la presencia de sedimento residual en el sobrenadante. Recoja el sobrenadante sin perturbar el precipitado y transfiéralo a la columna de unión. Coloque las columnas de unión de ADN en la capa portacolumnas del soporte.

Coloque las tapas de las columnas en las ranuras designadas para asegurarlas durante la centrifugación. Coloque las columnas de clarificación o filtración en la capa de columna de filtro directamente encima de las columnas de unión. Transfiera el lisado neutralizado preparado a las columnas de filtración.

Coloque el bastidor ensamblado en un rotor de platina con cubetas oscilantes. Centrifugue a 2000 G durante un minuto a temperatura ambiente. Después de retirar el bastidor de la centrífuga, retire y deseche la capa de la columna de filtro.

Deseche el flujo que sale del depósito en un recipiente de desecho. Vuelva a armar el soporte con las columnas de unión. Añada de 500 a 700 microlitros de tampón de lavado a cada columna de unión.

Centrifugar a 2000 G durante un minuto. Desechar el flujo que pasa por el depósito y repetir el paso de lavado como se demostró previamente. Retirar las columnas de unión del soporte y transferirlas a tubos colectores de dos mililitros.

Centrifugar a 10.000 G o más durante un minuto para secar la membrana. Transferir las columnas a tubos limpios de 1,5 mililitros. Añadir 50 microlitros de tampón de elución o agua directamente sobre la membrana e incubar las columnas durante un minuto a temperatura ambiente.

Centrifugar a 10.000 G o más durante un minuto para eluir el ADN. El rendimiento total de plásmido no mostró diferencias significativas entre el método convencional y la extracción utilizando las configuraciones de gradilla. La confirmación del plásmido se mantuvo con distribuciones similares de formas relajadas, linealizadas y superenrolladas.

La distribución del colorante se limitó a la zona de desecho directamente debajo de las columnas cargadas, sin señal visible detectada en pozos adyacentes ni en las puntas de columnas vecinas, lo que indica que el diseño del soporte reduce la probabilidad de salpicaduras y de transferencia entre columnas. La amplificación se detectó únicamente en los eluidos de las columnas a las que se había añadido el amplicón. Esta partícula permite a los investigadores obtener ADN plasmídico de alta calidad para aplicaciones posteriores, incluyendo clonación, secuenciación y análisis por PCR.

La consideración más importante al realizar este protocolo es prevenir la contaminación cruzada mediante el uso de un reservorio impermeable y sin superposiciones impreso en 3D. Además, tras seguir este procedimiento, estos soportes pueden utilizarse para cualquier análisis de extracción de ácidos nucleicos basado en columnas.