Detección de senescencia usando luz reflejada en la fracción vascular estromal adiposa

Estudiamos la senescencia de los adipocitos en diferentes depósitos de grasa y condiciones metabólicas, como la obesidad y la hiperinsulinemia. Los ensayos SABG tradicionales basados en Brightfield realmente no permiten multiplexar y son muy subjetivos. Nuestro nuevo protocolo es menos subjetivo y permite la multiplexación.

Para empezar, recupera el tubo que contiene el tejido adiposo humano. Homogeneizar 10 gramos de tejido adiposo y añadirlo a un tubo que contiene una enzima colágena tipo uno al 0,05% para obtener aproximadamente un millón de células de fracción vascular estromal, o SVF. Alicuota 500.000 celdas en cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Añade un mililitro de paraformaldehído al 2% al tubo para fijar la célula. Luego, incuba en un balancín a temperatura ambiente durante 20 minutos. Centrifuga a 600G durante 10 minutos y retira el sobrenadante.

Prepara la solución de tinción X-Gal utilizando el kit de tinción de senescencia beta-galactosidasa según las instrucciones del fabricante. Añade un mililitro de la solución de tinción en tres tubos nuevos. Y ajusta el pH a cinco, seis y ocho usando soluciones molares de ácido clorhídrico o un molar de hidróxido de sodio.

Usa un medidor de pH calibrado para verificar el pH. Añadir la solución de tinción X-Gal ajustada con pH a cada uno de los tubos etiquetados que contienen 500.000 celdas. Incuba a 37 grados Celsius durante 24 horas sin dióxido de carbono.

Centrifuga las celdas a 600G durante 10 minutos. Después de retirar el sobrenadante, lava las células con PBS. Y centrifugar de nuevo a 600G durante 10 minutos.

Una vez retirado el sobrenadante, para identificar las células endoteliales dentro de la SVF heterogénea, incubar las células con CD31 específico de células endoteliales o controlar anticuerpos primarios IgG a cuatro grados Celsius durante la noche. Lava las células tres veces con PBST al 0,1% durante 10 minutos a temperatura ambiente sobre un balancín para eliminar el anticuerpo primario no unido. Y centrifugar a 600G durante 10 minutos.

Después de descartar el sobrenadante, incuba las células con un anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente sobre un balancín. Centrifugar a 600G durante 10 minutos para eliminar la solución secundaria de anticuerpos para tinción. Lava las células tres veces usando PBST y luego centrifuga como se ha demostrado antes.

Resuspende las células en el montaje antifade. Pipete la suspensión celular sobre láminas de microscopio y cura durante la noche a temperatura ambiente para inmovilizar las células. Al día siguiente, añade 100 microlitros de glicerol al 100%.

Coloca un vestivestido de cubierta encima y sella con esmalte de uñas. Coloca la lámina preparada en el escenario de un microscopio confocal. En la interfaz del software del microscopio, selecciona la opción Camino de Luz y ajusta la configuración del divisor de haz a T90R10.

A continuación, verifica los valores de longitud de onda de corte para los espejos dicróicos secundarios, o SDMs, en la configuración de Espejo. En el menú del Detector, haz clic en la opción Seleccionar Colorante y Detector para asignar canales y longitudes de onda de excitación. Luego, configura los valores porcentuales de intensidad de potencia del láser para cada láser específico en el rango del 10 al 15%. En el menú de la serie, en la sección LSM, desactiva la opción Z a Activado. Ajusta el tamaño del paso Z al óptimo del sistema de 0,74 micrómetros.

A continuación, en el menú de Sección Z, introduce el valor del campo de entrada de inicio y define una pila Z basada en la señal de membrana para capturar el volumen completo de la celda. En el panel Adquirir, introduce el nombre del archivo y la ubicación de guardado en el campo de entrada LSM. Y haz clic en LSM Start para iniciar la adquisición de imagen.

Y guarda los archivos en nuestro formato nativo de microscopio. Tras la adquisición, utiliza las flechas de navegación Z para verificar la señal y la distribución focal de diferentes tintes a lo largo de toda la pila Z. Sube el archivo guardado a Imagen J.In la ventana emergente de Opciones de Importación de Bio-Formatos, haz clic en Vale.

Haz clic en el menú de imágenes para abrir el archivo. Y desde las opciones desplegables, selecciona Color y luego la opción de Dividir canales para abrir los diferentes canales como ventanas separadas. A continuación, ajusta el contraste de brillo y optimiza los valores de LUT usando la opción Ajustar en el menú Imagen para una visualización mejorada de la imagen.

Utiliza la barra de desplazamiento del eje Z en la parte inferior del fotograma para recorrer las secciones ópticas y verificar las características celulares a lo largo de la pila. En el menú de Imagen, selecciona Stack. Luego, selecciona la función Z Project para generar proyecciones de intensidad sumada de la imagen confocal tridimensional.

En el cuadro de diálogo de Proyección Z, define los rangos de corte de inicio y fin. Selecciona el tipo de proyección y haz clic en Vale para obtener la imagen compuesta 2D final. A continuación, navega al menú Imagen.

Selecciona la opción Tipo para ajustar el tipo de imagen a 16 bits. Luego, guarda y exporta las imágenes como archivos TIF de 16 bits. Importa las imágenes guardadas en CellProfiler versión 4.2.8 para segmentación automática de celdas, cuantificación de la intensidad de luz reflejada para cada celda y exportación de los valores de medición de intensidad a una hoja de cálculo.

En la hoja de cálculo, define el umbral para la positividad de beta-galactosidasa asociada a la senescencia como la suma de la intensidad media de luz reflejada de la condición de pH 8 más tres desviaciones estándar. Clasificar las células en condición de pH 6 como beta-galactosidasa asociada a la senescencia positiva si sus valores de intensidad superan el umbral establecido. La tinción beta-galactosidasa asociada a la senescencia con luz reflejada en células SVF humanas produjo patrones claros y reproducibles a lo largo de tres niveles de pH.

A pH 5, la mayoría de las células mostraban una señal fuerte debido a una alta actividad enzimática endógena. Al valor estándar del ensayo pH 6, la intensidad y frecuencia de la señal disminuyeron, permitiendo la identificación específica de células beta-galactosidasa asociadas a la senescencia. A pH 8, la señal era mínima, y esto servía como referencia para definir el umbral de positividad.

Las pruebas de sensibilidad de detección mostraron que la imagen de luz reflejada superó a Brightfield en todas las condiciones de pH. A pH 5, la luz reflejada mostró fuertes precipitados X-Gal, mientras que Brightfield solo captó los depósitos más grandes. A pH 6, la luz reflejada identificó células positivas que eran demasiado débiles o difusas para ser vistas en Brightfield.

A pH 8, la imagen por luz reflejada detectó una señal mínima, compatible con baja actividad enzimática, superando a Brightfield en la identificación de precipitados X-Gal en niveles de actividad intermedios y bajos. En conjunto, este flujo de trabajo de imagen con luz reflejada integra la detección simultánea de beta-galactosidasa asociada a la senescencia dependiente del pH y marcadores basados en fluorescencia, como CD31, facilitando evaluaciones de senescencia multifunción con resolución celular única dentro de poblaciones heterogéneas de SVF. Este protocolo permite mediciones sensibles y cuantitativas de la actividad del SABG mientras permite simultáneamente tanto otros marcadores de senescencia como otros marcadores celulares.

El principal reto, diría yo, es la configuración inicial de la microscopía. Pero una vez optimizado eso, puedes usar los mismos parámetros de adquisición entre experimentos. Estudios futuros pueden combinar este ensayo con otros marcadores subcelulares para ver cómo se relaciona la SABG con diferentes procesos celulares.