Name: Marcado metabólico del transcriptoma naciente en Xenopus embriogénesis temprana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprende a marcar y enriquecer transcriptomas nacientes mediante microinyección de 5-EU en embriones de Xenopus laevis. Este protocolo permite analizar con precisión la activación del genoma zigótico durante la embriogénesis temprana.

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<ol><li>Lee, M. T., Bonneau, A. R., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotic+genome+activation+during+the+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zygotic genome activation during the maternal-to-zygotic transition.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 581-613 (2014).</li>
<li>Jukam, D., Shariati, S. aM., Skotheim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotic+genome+activation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Zygotic genome activation in vertebrates.</a> Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition revisited.</a> Development. 146 (11), (2019).</li>
<li>Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition%3A+Reprogramming+of+the+cytoplasm+and+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus.</a> Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).</li>
<li>Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+zygotic+genome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The timing of zygotic genome activation.</a> Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).</li>
<li>Tadros, W., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition%3A+A+play+in+two+acts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition: A play in two acts.</a> Development. 136 (18), 3033-3042 (2009).</li>
<li>Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-zygotic+transition%3A+Death+and+birth+of+rnas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The maternal-zygotic transition: Death and birth of rnas.</a> Science. 316 (5823), 406-407 (2007).</li>
<li>Chen, H., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+transcriptome+reveals+orchestration+of+zygotic+genome+activation+in+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis.</a> Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).</li>
<li>Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterning+of+zygotic+genome+activation+in+a+model+vertebrate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo.</a> Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+nascent+transcription+in+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying nascent transcription in early embryogenesis.</a> Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).</li>
<li>Heyn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+earliest+transcribed+zygotic+genes+are+short%2C+newly+exmaved%2C+and+different+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The earliest transcribed zygotic genes are short, newly exmaved, and different across species.</a> Cell Rep. 6 (2), 285-292 (2014).</li>
<li>Bhat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slamseq+resolves+the+kinetics+of+maternal+and+zygotic+gene+expression+during+early+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Slamseq resolves the kinetics of maternal and zygotic gene expression during early zebrafish embryogenesis.</a> Cell Rep. 42 (2), 112070(2023).</li>
<li>Palozola, K. C., Donahue, G., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eu-rna-seq+for+in+vivo+labeling+and+high+throughput+sequencing+of+nascent+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Eu-rna-seq for in vivo labeling and high throughput sequencing of nascent transcripts.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100651(2021).</li>
<li>Kwasnieski, J. C., Orr-Weaver, T. L., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+genome+activation+in+drosophila+is+extensive+with+an+initial+tendency+for+aborted+transcripts+and+retained+introns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Early genome activation in drosophila is extensive with an initial tendency for aborted transcripts and retained introns.</a> Genome Res. 29 (7), 1188-1197 (2019).</li>
<li>Chan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brd4+and+p300+confer+transcriptional+competency+during+zygotic+genome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Brd4 and p300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation.</a> Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+in+vitro+fertilization+and+natural+mating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmon+provides+fast+and+bias-aware+quantification+of+transcript+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.</a> Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+rna-seq+data+with+deseq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for rna-seq data with deseq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+universal+rna-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Ultrafast universal rna-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Chen, H., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+nascent+transcription+in+wholemount+vertebrate+embryos+to+characterize+zygotic+genome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation.</a> Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).</li>
<li>Ma, S., Hong, Y., Chen, J., Xu, J., Shen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+nascent+transcription+reveals+sparse+genome+usage+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell nascent transcription reveals sparse genome usage and plasticity.</a> Cell. 188 (24), 6873-6891.e23 (2025).</li>
<li>Battich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+metabolically+labeled+transcripts+in+single+cells+reveals+mrna+turnover+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequencing metabolically labeled transcripts in single cells reveals mrna turnover strategies.</a> Science. 367 (6482), 1151-1156 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>& micro; Microinyector PUPM</td><td>Instrumentos de Precisión Mundial</td><td>UPUMP</td><td>Para microinyección (microinyección con presión)</td></tr><tr><td>5-etinila uridina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E10345</td><td>Para microinyección (marcado de traqnscripts incipientes)</td></tr><tr><td>Estereoscópicos Zoom ACCU-SCOPE 3075</td><td>VWR</td><td>470351-130</td><td>Para microinyección (visualización de embriones)</td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td>Para la precipitación de ARN</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7506</td><td>Para la reacción de clic</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio borosilicato</td><td>Instrumentos de Precisión Mundial</td><td>TW100-4</td><td>Para microinyección (fabricación de agujas de vidrio)</td></tr><tr><td>Centrifugadora</td><td>Eppendorf</td><td>5425R</td><td>Para centrifugadora</td></tr><tr><td>Kit de captura de ARN Nacente Click-iT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10365</td><td>Para biotinilar y purificar ARN naciente</td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61230</td><td>Para la reacción de clic</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4716728001</td><td>Para la extracción de ARN</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0300-10</td><td>Para microinyección (incubación de embriones)</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio (60 mm)</td><td>VWR</td><td>75845-542</td><td>Para fertilización</td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td>Para la precipitación de ARN</td></tr><tr><td>Aceite de Halocarbono 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td>Para microinyección (calibración del volumen de inyección)</td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149</td><td>Para embriones que dejan en peligro</td></tr><tr><td>Puntas de microcargador</td><td>calibre scientific</td><td>EPE-5242956003</td><td>Para microinyección (cargando 5-EU en la aguja de vidrio)</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit para Illumina</td><td>NEB</td><td>E7630</td><td>Para la cuantificación de bibliotecas</td></tr><tr><td>NSQ 500/550 Alta Salida KT v2.5 (75 CYS)</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>Para secuenciación</td></tr><tr><td>Fluorómetro Qubi Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P33327</td><td>Para medir la concentración de ARN</td></tr><tr><td>Kit de unión de ARN HS con qubits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P32852</td><td>Para medir la concentración de ARN</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Para la extracción de ARN</td></tr><tr><td>Micrometro de etapa</td><td>La ciencia de Ward</td><td>470175-914</td><td>Para microinyección (calibración del volumen de inyección)</td></tr><tr><td>Universal RNA-seq con NuQuant</td><td>NuGEN</td><td>0364</td><td>Para la preparación de la biblioteca</td></tr></tbody></table>

marcado metabólico del transcriptoma naciente en xenopus embriogénesis temprana

Metabolic Labeling of the Nascent Transcriptome in Xenopus Early Embryogenesis

Marcado metabólico del transcriptoma naciente en Xenopus embriogénesis temprana

Early embryogenesis requires new transcription of zygotic genes from the initially dormant zygotic genome after fertilization. A major challenge has been ...

metabolic-labeling-nascent-transcriptome-xenopus-early

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Un método de hacer clic química base que permite el etiquetado rápido, no invasivo, y robusto de alquino con etiquetas glicanos en embriones de pez cebra se describe. Glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra en la etapa de gastrulación finales fueron estudiados en este estudio.

Glicanos imágenes en embriones de pez cebra mediante marcado metabólico y Química Haga clic Bioorthogonal

El ARN celular total proporciona una plantilla pobres para el estudio de los cambios a corto plazo en la síntesis de ARN y la descomposición, así como la cinética de procesamiento del ARN. A continuación, describimos marcaje metabólico de ARN recién transcrito con 4-tiouridina seguido por biotinilación específico de tiol y la purificación de ARN recién transcrito que permiten superar estas limitaciones.

Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular

La cuestión de cómo los reguladores y los estados de la cromatina cromatina afecta al genoma in vivo es fundamental para nuestra comprensión de cómo los primeros se toman las decisiones del destino celular en el embrión en desarrollo. Chip-Sec-el método más popular para investigar las características de la cromatina en un nivel se describe aquí mundial para los embriones de Xenopus.

Instantánea de todo el genoma de los Reguladores de la cromatina y los Estados en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones por chip-Sec

Describimos a una plataforma de análisis de ARN de transferencia original llamada SPOt (plataforma optimizada para la observación de tRNA). Lugar simultáneamente mide los niveles celulares de todos los tRNAs en muestras biológicas, en sólo tres pasos y en menos de 24 horas.

Etiquetado metabólico y perfiles de RNAs de transferencia utilizando Macroarrays

Describimos los pasos que permiten muestreo rápido in situ de una pequeña porción de una célula individual de alta precisión y mínima invasión, mediante micro-muestras basadas en el tubo capilar, para facilitar la caracterización química de una instantánea de la actividad metabólica en embriones vivos utilizando una plataforma de espectrometría de masas y electroforesis capilar célula hecha a la medida.

Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

El protocolo aquí descrito se basa en la cuantificación del genoma de mRNA recién sintetizada purificada de células de levadura con 4-tiouracilo. Este método permite para medir la síntesis de mRNA desacoplado del decaimiento del mRNA y por lo tanto, proporciona una medida exacta de la transcripción del RNA polimerasa II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Aquí describimos una caracterización proteómica basada en espectrometría de masas de linajes celulares con destinos tisulares conocidos en el embrión vertebrado de Xenopus laevis .

Proteómica de espectrometría de masas guiada por linaje celular en el embrión en desarrollo (rana)

Describimos métodos para visualizar la transcripción naciente durante la activación del genoma cigótico en células individuales durante la embriogénesis temprana.

Visualización de la activación del genoma cigótico en células individuales de embriones tempranos

Aprende a marcar y enriquecer transcriptomas nacientes mediante microinyección de 5-EU en embriones de Xenopus laevis. Este protocolo permite analizar con precisión la activación del genoma zigótico durante la embriogénesis temprana.

Marcado metabólico del transcriptoma naciente en Xenopus embriogénesis temprana

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