Marcado metabólico del transcriptoma naciente en Xenopus embriogénesis temprana

En este estudio, investigamos cómo ocurren la activación del gen cigótico y la regulación transicional durante la génesis temprana del embrión de xenopus. Los métodos existentes luchan por detectar los nuevos transcritos cigóticos activados que emiten abundantes ARN maternos. Este protocolo etiqueta y enriquece las transcripciones incipientes.

Para empezar, coloca la cámara de microinyección bajo un microscopio estereoscópico y añade un mililitro de solución de Ficoll en la cámara. Obtener embriones de Xenopus laevis almacenados en ringers modificados o solución MMR de 0,1X. Utiliza una pipeta de transferencia de plástico para transferir 20 o más embriones al centro de la cámara de microinyección.

Prepara la aguja de inyección cortando la punta fina de una aguja de cristal con unas pinzas. Coloca la aguja verticalmente con la punta hacia abajo y carga 0,5 microlitros de 50 mM de 5-etiniluridina o 5 M EU usando una pipeta P2 con punta microcargadora. Monta la aguja en un micromanipulador.

Utilizando una pipeta P10, coloca 10 microlitros de aceite de halocarbono sobre un micrómetro de escenario situado bajo un microscopio estereoscópico. Para calibrar el volumen, pulsa el pedal del microinyector e inyecta una gota en el aceite de halocarbono del micrómetro. Ajusta la presión y el tiempo de inyección en el microinyector hasta que el diámetro de la gota sea de 0,27 milímetros.

Sujetar el embrión de una sola fase celular con pinzas y controlar la aguja con el micromanipulador para inyectar 10 nanolitros de 50 mM 5 EU. Transfiere los embriones inyectados a una nueva bandeja de cristal con solución de Ficoll e incuba durante una hora. Elimina la solución de Ficoll y añade una solución XMMR 0.1. Inspecciona visualmente los embriones durante el desarrollo y elimina cualquier embrión anormal si es necesario.

Transfiere 10 embriones en la etapa de desarrollo deseada a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Retira cualquier medio residual del tubo, congela rápidamente los embriones en nitrógeno líquido y guárdalos en un congelador a menos 80 grados Celsius. Luego extrae ARN total de los embriones y mide su concentración utilizando kits comerciales.

Para realizar una reacción de clic de 50 microlitros, mezcla los componentes mostrados en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Incuba la mezcla de reacción en un nutator a temperatura ambiente durante 30 minutos. Ahora añade glucógeno, acetato de amonio y etanol frío a cada mezcla de reacción.

Mezcla bien pipeteando cinco veces. Incuba toda la noche en un congelador a menos 80 grados Celsius. Tras la incubación nocturna, centrifugar a 13.000 g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius, y luego retirar el sobrenadante sin alterar el pellet.

Lava el pellet dos veces con 700 microlitros de etanol al 75%. Tras centrifugar y descartar el sobrenadante, seca al aire el pellet a temperatura ambiente durante cinco a diez minutos y vuelve a suspender el pellet en 10 microlitros de agua libre de RNasa. Dispensa cinco microlitros de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina en un nuevo tubo de 1,5 mililitros.

Añade nueve microlitros de buffer de lavado 2 a las esferas y mezcla bien. Coloca el tubo sobre una rejilla magnética durante dos minutos. Quita el sobrenadante y repite los lavados dos veces más.

Luego vuelve a suspender las perlas en cinco microlitros de buffer de lavado 2. Prepara una mezcla maestra en un tubo microcentrífuga de 1,5 microlitros. Añade 15 microlitros de la mezcla maestra a cada tubo que contenga la muestra de ARN.

Coloca el tubo sobre un bloque térmico e incuba a 69 grados Celsius durante cinco minutos. Después, pon el tubo en hielo. Luego añade cinco microlitros de perlas prelavadas a cada muestra de ARN e incuba en un nutador a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Lava los complejos de ARN de las perlas cinco veces con un tampón de lavado 1 de 50 microlitros, seguido de cinco lavados con tampón de lavado 2 de 50 microlitros. Resuspende las perlas en un buffer de lavado de cinco microlitros 2. Utiliza directamente las perlas que contienen los ARN de la UE incipientes para la síntesis complementaria de ácidos desoxirribonucleicos y la preparación de la biblioteca.

Se detectaron un número creciente de genes activados diferencialmente durante la activación del genoma cigótico cuando el transcriptoma naciente a las seis horas de la fertilización se comparó con el de cinco horas después de la fertilización, observándose aumentos adicionales a las siete horas después de la fertilización, ocho horas después de la fertilización y nueve horas después de la fertilización. Los genes cigóticos se detectaron en niveles más altos y en momentos anteriores en los datos incipientes de secuenciación de ARN de la UE en comparación con los datos totales de secuenciación de ARN. La purificación cuidadosa de ARN emergentes marcados metabólicamente es el factor más crítico para garantizar la sensibilidad y especificidad en este protocolo.

Los ARN emergentes marcados por la UE producidos mediante este protocolo pueden analizarse bioquímicamente in vitro. Este enfoque permite que futuros estudios investiguen patrones de activación genómica, expresión génica específica de tejidos y mecanismos reguladores como resolución unicelular.