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	<li>Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+skin+and+intrinsic+aging:+biological,+environmental,+and+therapeutic+insight.">Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight.</a> J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).</li><li>Dorf, N., Maciejczyk, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+senescence-from+basic+research+to+clinical+practice.">Skin senescence-from basic research to clinical practice.</a> Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).</li><li>Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+cigarette+smoke+and+solar+rays+causes+effects+similar+to+skin+aging+in+a+bilayer+skin+model.">The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model.</a> Sci Rep. 13, 17969 (2023).</li><li>Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+collagen+production+in+chronologically+aged+skin:+roles+of+age-dependent+alteration+in+fibroblast+function+and+defective+mechanical+stimulation.">Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation.</a> Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).</li><li>Zhang, S., Duan, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fighting+against+skin+aging:+the+way+from+bench+to+bedside.">Fighting against skin aging: the way from bench to bedside.</a> Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).</li><li>Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+antioxidants+in+skin+aging+and+the+molecular+mechanism+of+ROS:+a+comprehensive+review.">Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review.</a> Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).</li><li>Addor, F. A. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+photoaging:+additional+factors+involved+in+the+process+of+skin+aging.">Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging.</a> Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).</li><li>Mucha, M., Skrzydlewska, E., GÄ™gotek, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+protection+against+oxidative+stress+in+human+skin+melanocytes.">Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes.</a> Commun Biol. 8, 1283 (2025).</li><li>Hughes, B. K., Bishop, C. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+role+of+senescent+melanocytes+in+skin+ageing.">Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing.</a> Biomedicines. 10, 3111 (2022).</li><li>Kami&#324;ski, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+melanogenesis+and+melanoma+development.">Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development.</a> Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).</li><li>Jim&#233;nez-Cervantes, C., Mart&#237;nez-Esparza, M., P&#233;rez, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanogenesis+in+response+to+oxidative+stress:+transient+downregulation+of+melanocyte+differentiation+markers+and+possible+involvement+of+microphthalmia+transcription+factor.">Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor.</a> J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).</li><li>Da&#324;czak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Pola&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+skin-related+research:+targeted+signaling+pathways+and+naturally+occurring+therapeutic+agents.">Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents.</a> Aging Cell. 22, e13845 (2023).</li><li>Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dangerous+liaisons:+loss+of+keratinocyte+control+over+melanocytes+in+melanomagenesis.">Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis.</a> Bioessays. 46, e2400135 (2024).</li><li>Ali, L., Al Niaimi, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+melasma+explained.">Pathogenesis of melasma explained.</a> Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).</li><li>Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+is+the+evidence+that+cellular+senescence+causes+skin+ageing.">How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing.</a> Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).</li><li>Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cellular+senescence+in+skin+aging+and+age-related+skin+pathologies.">The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies.</a> Front Physiol. 14, 1297637 (2023).</li><li>Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+senescence-associated+phenotype+in+human+skin+fibroblasts.">Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts.</a> Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).</li><li>Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cellular+senescence+in+human+primary+melanocytes+and+malignant+melanoma+cells+in+vitro.">Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro.</a> Cells. 11, 1489 (2022).</li><li>Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+human+face+skin+melanocytes+for+the+study+of+hyperpigmentation.">Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation.</a> Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).</li><li>Ku&#269;era, O., Endlicher, R., Rou&#353;ar, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tert-butyl+hydroperoxide-induced+oxidative+stress+on+lean+and+steatotic+rat+hepatocytes+in+vitro.">The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro.</a> Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).</li><li>Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBHP+treatment+as+a+model+for+cellular+senescence+and+pollution-induced+skin+aging.">tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).</li><li>Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+oxidative+stress+upregulates+drusen-related+protein+expression+in+adult+human+RPE+stem+cell-derived+RPE+cells:+a+novel+culture+model+for+dry+AMD.">Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD.</a> Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).</li><li>Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+make+human+skin+models+based+on+cellular+senescence+for+ageing+research.">Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research.</a> Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).</li><li>Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanocyte+lineage+in+development+and+disease.">The melanocyte lineage in development and disease.</a> Development. 142, 620-632 (2015).</li><li>Goff, P. S., Castle, J. T., Kohli, J. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transfection+of+melanocytes.">Isolation, culture, and transfection of melanocytes.</a> Curr Protoc. 3, e774 (2023).</li><li>Martic, I., Wedel, S., Jansen-DÃ¼rr, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+to+investigate+UVB-induced+cellular+senescence+and+pigmentation+in+melanocytes.">A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).</li><li>Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+human+melanocytes+drive+skin+ageing+via+paracrine+telomere+dysfunction.">Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction.</a> EMBO J. 38, e101982 (2019).</li><li>Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+response+and+Nrf2+signaling+in+aging.">Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging.</a> Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).</li><li>Birch, J., Gil, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+SASP:+many+therapeutic+avenues.">Senescence and the SASP: many therapeutic avenues.</a> Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).</li><li>Kang, H. Y., Ortonne, J. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+should+be+considered+in+treatment+of+melasma.">What should be considered in treatment of melasma.</a> Ann Dermatol. 22, 373-378 (2010).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+cell+senescence,+and+novel+molecular+mechanisms+in+aging+and+age-related+diseases.">ROS, cell senescence, and novel molecular mechanisms in aging and age-related diseases.</a> Oxid Med Cell Longev. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Almeida, F. V., Douglass, S. M., Fane, M. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+company:+microenvironmentally+mediated+resistance+to+targeted+therapy+in+melanoma.">Bad company: microenvironmentally mediated resistance to targeted therapy in melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 32, 237-247 (2019).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochem Photobiol. 84, 539-549 (2008).</li><li>L&#243;pez-Ot&#237;n, C., Blasco, M. A., Partridge, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153, 1194-1217 (2013).</li><li>Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+melanogenesis.">Mechanisms regulating melanogenesis.</a> An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).</li><li>Ratz-&#321;yko, A., Arct, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+as+an+active+ingredient+for+cosmetic+and+dermatological+applications:+a+review.">Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review.</a> J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).</li><li>Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senolytics+improve+physical+function+and+increase+lifespan+in+old+age.">Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age.</a> Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).</li><li>Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+senescent+cell+clearance+alleviates+age-related+brain+inflammation+and+cognitive+impairment+in+mice.">Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice.</a> Aging Cell. 20, e13296 (2021).</li><li>Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+transcriptional+heterogeneity+in+senescent+cells.">Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells.</a> Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m membrane filter</td><td>Merck&nbsp;</td><td>SLGVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>1 M citric acid&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>K91567844</td><td>preparer en aq. dest.</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Merck</td><td>A649033</td><td>preparer en aq. dest.</td></tr><tr><td>1 M Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>K56036736</td><td>preparer en aq. dest.</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Lab Honeywell</td><td>30620</td><td>preparer en aq. dest.</td></tr><tr><td>37% formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>CarlRoth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>5 M Sodium Chloride&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>preparer en aq. dest.</td></tr><tr><td>50% glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-&beta;-D-Galactopyranosid (X-Gal)</td><td>Sigma</td><td>B9146</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>BSA (bovine serum albumin)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent substrate</td><td>Sigma</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Costar CellLifter&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips for cell culture/microscopy</td><td>Epredia</td><td>CB00200RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>DermaLife Basal Medium</td><td>CellSystems</td><td>LM-0004</td><td></td></tr><tr><td>DermaLife M Melanocyte Kit&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS-1041</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Human neonatal melanocytes</td><td>CellSystems</td><td>FC-0023</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1 antibody (rabbit)</td><td>Abcam</td><td>AB16048</td><td>Dilución 1:1000 en 5% BSA</td></tr><tr><td>Mounting medium containing DAPI</td><td>Abcam</td><td>AB104139</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide gradient gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A38904-01</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferrocyanide</td><td>Sigma</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>pRB antibody (rabbit)</td><td>CellSignalling</td><td>93085</td><td>Dilución 1:1000 en 5% BSA</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>self prepared</td><td>N/A</td><td>500 mM NaF; 2 &micro;g/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate</td></tr><tr><td>RIPA buffer&nbsp;</td><td>self prepared</td><td>N/A</td><td>contiene: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>RLT buffer</td><td>Qiagen</td><td>1015762</td><td>Incluido en RNeasy Mini Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate (for 0.1% solution)</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)</td><td>Sigma</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (for 0.3% solution)</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>CarlRoth</td><td>4227.3</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;H2AX antibody (rabbit)</td><td>CellSignalling</td><td>2577S</td><td>Dilución 1:200&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un protocolo estandarizado para inducir la senescencia prematura inducida por estrés en melanocitos humanos primarios utilizando hidroperóxido de tert-butil

A Standardized Protocol for Inducing Stress-Induced Premature Senescence in Primary Human Melanocytes Using Tert-butyl Hydroperoxide

Un protocolo estandarizado para inducir la senescencia prematura inducida por estrés en melanocitos humanos primarios utilizando hidroperóxido de tert-butil

Environmental stressors, including UV radiation, air pollution, or cigarette smoke, drive extrinsic skin aging. Exposure to these extrinsic aging factors ...

Nuestra investigación se centra en estudiar el fenotipo de senescencia de los melanocitos y su contribución al envejecimiento cutáneo extrínseco. Los modelos establecidos de senescencia utilizan fibroblastos y no logran captar la biología específica de los melanocitos. Este protocolo induce estrés oxidativo mediado por tBHP en melanocitos humanos primarios.Para comenzar, reúna los reactivos necesarios. Después de descongelar los melanocitos y permitir que se recuperen durante tres días, asegúrese de que las células alcancen una confluencia del 80 al 90 % el día de siembra. Aspire el medio del frasco. Lave las células dos veces con DPBS. Añada dos mililitros de solución de tripsina-EDTA para desprender las células. Coloque el matraz en el incubador durante cinco minutos a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono.Toque suavemente el matraz. Y bajo el microscopio, observe las células para confirmar la disociación completa. Añada 1,5 veces el volumen del inhibidor de tripsina para detener la reacción.Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Diluya la suspensión con DPBS hasta un volumen final de 10 mililitros. Centrifugue la suspensión celular a una fuerza centrífuga relativa de 100 durante cinco minutos.Aspire el sobrenadante y re-suspenda el sedimento celular en medio hasta el volumen deseado. Siembre 600.000 células por placa de 10 centímetros para las placas tratadas con hidroperóxido de tert-butilo, o tBHP. Siembre 400.000 células por placa para las placas de control.Prepare una solución de trabajo de 10 milimolar a partir del stock de tBHP utilizando DPBS o medio. Añada 100 micromolar de tBHP a las células durante una hora por cada tratamiento. Mueva la placa hacia adelante y hacia atrás para distribuir el tBHP uniformemente en todo el medio.Coloque las células en el incubador exactamente durante una hora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Aspire el medio para finalizar el tratamiento con tBHP. Lave las placas dos veces con DPBS precalentado a 37 grados Celsius.Añada el volumen adecuado de medio fresco a las placas. Coloque las placas en el incubador y permita que las células se recuperen durante al menos cuatro horas antes del siguiente tratamiento. Repita el procedimiento de tratamiento más tarde el mismo día para el segundo tratamiento.Continúe el régimen de tratamiento hasta el día cuatro, luego mantenga las células en cultivo hasta el día nueve para evaluar los marcadores de senescencia. Cuente las células tratadas con tBHP y las células de control. Siembre nuevamente las células a la misma densidad inicial, o si se obtienen menos de 600.000 células de las placas tratadas con tBHP, siembre nuevamente todas las células recolectadas.Cuente las células los días cuatro, nueve y 15 del cultivo. El día nueve, lave las células dos veces con PBS. Fije las células utilizando formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,4%.Lave las células fijadas dos veces con PBS. Incube las células fijadas en una solución de tinción a pH 6. Tape la placa para protegerla de la luz, luego incúbela durante 18 horas a 37 grados Celsius en ausencia de dióxido de carbono.Lave las células dos veces con PBS. Mediante microscopía de luz, obtenga imágenes y cuente el número de células teñidas de azul. Divida este valor por el número total de células dentro del mismo campo.Exprese los resultados como el porcentaje de células positivas. Tras la inducción del estrés oxidativo, el tratamiento con tBHP redujo significativamente la proliferación de melanocitos en comparación con los controles. Las células tratadas alcanzaron solo 1,4 duplicaciones poblacionales acumulativas, o cPDL, al noveno día, mientras que los controles alcanzaron 3,1 cPDL.Hacia el día 15, las células tratadas alcanzaron un plateau en 1,9 DLPC, mientras que las células de control se expandieron hasta 5,1 DLPC. Los melanocitos tratados con tBHP mostraron un aumento en el área de superficie celular en comparación con los controles en todos los puntos temporales medidos, con un ensanchamiento progresivo hasta el día 15, lo cual es consistente con la morfología agrandada y aplanada de las células senescentes. Los melanocitos tratados con tBHP mostraron un incremento en la actividad de beta-galactosidasa asociada a la senescencia, o actividad de beta-galactosidasa SA, con un 32 % de células positivas frente al 3 % en los controles.El aumento en la positividad de la SA-beta-galactosidasa fue consistente con un fenotipo senescente. El análisis de inmunofluorescencia mostró niveles elevados de gamma-H2AX en melanocitos tratados con tBHP en comparación con los controles. Las células tratadas mostraron una señal de gamma-H2AX más intensa que los controles.El análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real demostró un aumento en la expresión de factores del fenotipo secretor asociado a la senescencia, siendo la interleucina-8 la que mostró el incremento más elevado. Mientras que la interleucina-6 y la metaloproteasa de matriz-1 mostraron aumentos moderados. El análisis por inmunotransferencia confirmó la inducción de la senescencia.La laminina B1 mostró una reducción significativa en melanocitos tratados con tBHP en comparación con los controles. Los niveles de proteína retinoblastoma fosforilada se redujeron en melanocitos tratados con tBHP en comparación con los controles. El tratamiento con tBHP aumentó la expresión transcripcional de p16 y p21 en melanocitos.Este modelo permite a los investigadores estudiar cómo los melanocitos senescentes afectan la pigmentación y se comunican con las células circundantes mediante factores inflamatorios SASP. El desafío de este protocolo radica en el momento preciso. El tBHP debe aplicarse dos veces al día con un intervalo de al menos cuatro horas.Tras seguir este protocolo, la senescencia puede caracterizarse mediante tinción de beta-galactosidasa asociada a la senescencia, inmunofluorescencia, RT-qPCR y transferencia Western de marcadores de senescencia establecidos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

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