Name: Montaje y uso de un sistema de crecimiento gnotobióntico vegetal para estudios de interacción planta-microbio en cereales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprende a montar el sistema gnotobiótico GNOVA para cultivar cereales en condiciones microbianas controladas. Este protocolo permite estudiar interacciones planta-microbio más allá de la etapa de plántula.

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<table><tbody><tr><td>Powerconnect cordless drill &amp; 100-Piece Kit</td><td>Black+Decker</td><td>BDC120VA100</td><td>Se necesitan brocas de 1/4" y 1/8". </td></tr><tr><td>Vinyl tape, yellow, 1" wide x 36 yards&nbsp;</td><td>3M</td><td>471</td><td>Material consumible</td></tr><tr><td>Sterling Rubber bands size #32&nbsp; (2 rubber bands per system)</td><td>Amazon</td><td>B001I1QO00</td><td>Material consumible.&nbsp;</td></tr><tr><td>Wheat seed</td><td></td><td></td><td>Cultivar utilizado en este experimento: Catawba</td></tr><tr><td>Fiberglass pipe wrap insulation, 3 " widex 1/2 " thick&nbsp; (2 pre-cut circles per system)</td><td>Lowe's</td><td>28930</td><td>Corte en 2 círculos de 7/8 " (7.3 cm) de diámetro. Material consumible. Para una producción de alto rendimiento de círculos, desrolle el aislamiento de envoltura de tubo y use el borde abierto de la maceta para cortar el círculo colocando la maceta encima del aislamiento de envoltura y aplicando presión y giro. </td></tr><tr><td>DW4 Filter media, Pre-cut to 15" x 75 yards&nbsp; (1 cut circle per system)</td><td>Class Biological Clean, Ltd</td><td>NA</td><td>Corte en círculos de 6.3 " (16.02 cm) de diámetro. CBC tiene otros tamaños de rollo precortados o estándar que se pueden comprar en su lugar si lo desea.  Material consumible. corte una plantilla del círculo en cartón y úsela para dibujar círculos en toda el área del medio DW4 y corte con tijeras.</td></tr><tr><td>Silicon tubing, Versilon SPX-50 High-strength, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" wall thickness</td><td>Saint-Gobain</td><td>ABX00007</td><td>Corte en dos piezas largas ( 16" // 40.64 cm) y tres piezas cortas (2.5" // 6.35 cm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium hypoclorite 5% available chlorine in aqueous solution</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Diluido a 2% v/v y usar para el protocolo de esterilización de maíz</td></tr><tr><td>Murashige &amp; Skoog medium, micro and macro elements. 25 L</td><td>Research Products International</td><td>M10200-25.0</td><td>Diluir a 0.5x de fuerza</td></tr><tr><td>Ethanol, 100%, Deacon Labs</td><td>Fisher scientific</td><td>04-355-451</td><td>Diluido a 95% v/v</td></tr><tr><td>Syringe 3 mL, luer lock unsterile&nbsp; (2 per system)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-817-117</td><td>Deseche el émbolo y solo mantenga el barril, llene con lana de vidrio y tape con papel de aluminio.</td></tr><tr><td>Glass beakers, 250 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>470191-150</td><td>Se necesitan cinco para la esterilización de semillas de trigo</td></tr><tr><td>Maize seed</td><td></td><td></td><td>Genotipo utilizado en este experimento: Mexico 21&ndash;22 B73XMo17</td></tr><tr><td>Aluminum baking tray 18" x 26"&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>B01FIK54LQ</td><td>Asegúrese de que se ajuste a las dimensiones de su campana de flujo</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher scientific</td><td>BP358-1</td><td>Prepare una solución de 0.145 M.</td></tr><tr><td>3D printed base, polylactic acid (PLA) filament used (1 per system)</td><td>Protolabs</td><td>NA</td><td>La impresión y los archivos editados se pueden encontrar en los materiales suplementarios. Los archivos están disponibles en Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. NO AUTOCLAVE si se utilizó PLA como filamento para producir la base. PLA se derrite por encima de 150 &deg;C y puede deformarse por encima de 60 &deg;C. Se recomienda que se pruebe la integridad de la base impresa en 3D de PLA si se va a utilizar a temperaturas superiores a 40 &deg;C. Para materiales de mayor resistencia al calor, como PETG (polietileno tereftalato glicol) o PC (policarbonato), se puede utilizar en su lugar; esto aumentará el costo de la pieza y es posible que aún no sea autoclavable. La impresión 3D de los prototipos de base se realizó en una impresora personal con volúmenes de construcción de 256 &times; 256 &times; 256 mm (largo &times; ancho &times; alto). Para mayor rapidez y eficiencia en costos, recomendamos imprimir en grandes cantidades en proveedores de servicios de impresión 3D comerciales locales. </td></tr><tr><td>Male luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polypropelene&nbsp; (2 per system)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-50114-69</td><td>Referido como ajuste 1 en el protocolo</td></tr><tr><td>Male slip luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polyproylene&nbsp; (1 per system)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-50114-63</td><td>Referido como ajuste 2 en el protocolo</td></tr><tr><td>201 Stainless steel worm gear hose clamps, 1 1/2" -3 1/2" clamping diameter (1 per system)</td><td>Grainger</td><td>5CZF2</td><td>Referido como abrazaderas de manguera en el protocolo</td></tr><tr><td>Airstream Gen 3 Laminar flow cabinet with simple switch, dimensions 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 "&nbsp;</td><td>ESCO Lifesciences</td><td>2120707</td><td>Referido como campana de flujo laminar en el protocolo. Cualquier campana de flujo laminar con dimensiones similares funciona. Se pueden necesitar modificaciones en campanas de flujo más pequeñas. </td></tr><tr><td>Play sand, Quikrete Premium. 50 lb</td><td>The Home Depot</td><td>1001709466</td><td>Referido como arena en el protocolo</td></tr><tr><td>304 Stainless steel woven wire, 120 mesh (1 per system)</td><td>Amazon</td><td>B09KRS5F7T</td><td>Referido como malla de alambre de acero inoxidable en el artículo. Corte en círculos de 4.7" (11.9 cm) de diámetro. Para una alta producción de alto rendimiento o círculos, corte una plantilla del círculo en cartón y úsela para dibujar círculos en toda el área de la malla tejida de la malla tejida y corte con tijeras. </td></tr><tr><td>Clay (Montmorillonite), OIL-DRI Loose Sorbent, 50 lb Wt, not scented</td><td>Grainger</td><td>44Z111</td><td>Referido en el protocolo como arcilla. Material consumible.</td></tr><tr><td>Clear hurricane candle shade chimney tube without a bottom 4" OD x 30" length (1 per system)</td><td>WCG International</td><td>HST0430</td><td>Referido en el protocolo como cilindro de vidrio</td></tr><tr><td>Clear plastic cap, 3" (7.6 cm) diam&nbsp; (1 per system)</td><td>ClearTec Packaging</td><td>PCC3.000</td><td>Referido en el protocolo como tapa de plástico</td></tr><tr><td>Clear Polycarbonate tubing, 3" OD x 2 7/8" ID x 1/16' wall thickness x 12" length&nbsp; (1 per system)</td><td>ePlastics</td><td>PCTUB3.000X2.875</td><td>Referido en el protocolo como olla. Puede solicitar a la empresa que corte a otras longitudes deseadas.</td></tr><tr><td>Cleanroom

montaje y uso de un sistema de crecimiento gnotobióntico vegetal para estudios de interacción planta-microbio en cereales

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Montaje y uso de un sistema de crecimiento gnotobióntico vegetal para estudios de interacción planta-microbio en cereales

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Nuestra investigación estudia cómo los microorganismos colonizan las raíces de las plantas e influyen en la resiliencia de estas frente al estrés. Este protocolo puede aplicarse al estudio de las interacciones planta-microbio en una amplia variedad de especies vegetales, más allá de las tradicionales plantas modelo pequeñas.Para comenzar, tome las macetas preparadas para el experimento y retire la tapa de plástico. Vierta 378 mililitros de medio de Murashige y Skoog al 50 % en la maceta. Para los sustratos de arcilla y arena, utilice 360 y 350 mililitros, respectivamente, para alcanzar un 70 % de espacio poroso lleno de agua. Utilizando pinzas estériles, siembre las semillas esterilizadas a la profundidad correcta. Siembre el trigo a una profundidad de 0,5 pulgadas y el maíz a una profundidad de 1 pulgada. Reemplace la tapa de plástico en la parte superior de la maceta y luego retire la maceta del cabina. Alternativamente, siembre plántulas estériles previamente germinadas en GNOVA. Después de transferir la maceta y el cilindro de vidrio a una cámara de crecimiento, sostenga el cilindro de vidrio con la base orientada hacia abajo, cerca de la maceta. Sostenga la envoltura de esterilización y la tapa de plástico. En un solo movimiento, retire rápidamente la tapa de plástico de la maceta y la envoltura de esterilización del cilindro de vidrio. Baje el cilindro de vidrio sobre la parte superior y colóquelo sobre el reborde de la base impresa en 3D. Cultive el trigo a 22 grados Celsius durante el día y 16 grados Celsius durante la noche, bajo luz fluorescente con un fotoperiodo de 12 horas. Para el maíz, mantenga 27 grados Celsius durante el día y 23 grados Celsius durante la noche en las mismas condiciones.Conecte un trozo largo de tubo de silicona al dispensador de cuello de botella. Coloque la llama cerca de la línea de irrigación. Retire el cuerpo de la jeringa de la línea de irrigación y del soporte del filtro. Mantenga todos los extremos de los tubos dentro de la zona de la llama. Conecte el soporte del filtro a la línea de irrigación. Conecte los dos cuerpos de jeringa. A continuación, conecte el trozo largo de tubo unido al dispensador de cuello de botella al puerto inferior del soporte del filtro. Dispense 150 mililitros de medio de Murashige y Skoog a media concentración. Separe los dos cuerpos de jeringa. Desconecte el tubo de silicona del soporte del filtro y desconecte el soporte del filtro de la línea de irrigación. Reemplácelo por un cuerpo de jeringa.Utilice una estrategia de riego con lejía al 10 % en experimentos grandes con más de 50 muestras para aumentar el rendimiento del riego. Dispense solución de lejía al 10 % en volumen por volumen en dos pequeños vasos de plástico. Coloque los vasos cerca de la línea de riego y retire el cuerpo de la jeringa de la línea de riego. Sumerja los extremos del tubo en una solución de lejía al 10 % hasta que sea necesario. Retire el cuerpo de la jeringa del soporte del filtro. Sumerja todos los extremos del tubo en la solución de lejía al 10 % hasta que sea necesario. Sacuda el exceso de solución de lejía. Conecte el soporte del filtro a la línea de riego de las macetas. Conecte el tramo largo del tubo conectado al dispensador de tapón de botella al puerto inferior del soporte del filtro. Dispense 150 mililitros de medio de Murashige y Skoog a media concentración. Desconecte el tramo largo del tubo de silicona del puerto inferior del soporte del filtro. Reemplace el filtro en la línea de riego con un cuerpo de jeringa después de eliminar el exceso de lejía. Si cambia el volumen de riego, utilice aproximadamente 20 mililitros de medio para cebra la línea.Modifique el protocolo de cosecha para alinearlo con los objetivos específicos de la investigación y el volumen de muestras que se procesan. Retire el cilindro de vidrio de la maceta. Coloque rápidamente la maceta en la cabina de flujo laminar y extráigala de la base impresa en 3D. Sujete la planta por la base y vierta el sustrato de suelo en un recipiente. Retire suavemente los grandes terrones de suelo de las raíces. Si es necesario, recoja muestras de suelo de acuerdo con los objetivos específicos de la investigación. Utilizando tijeras estériles, separe los brotes de las raíces. Registre el peso fresco de los brotes. Limpie las raíces agitándolas suavemente en un vaso de precipitados que contenga agua desionizada. Séquelas por absorción. Registre el peso fresco de las raíces y, si es necesario, recoja muestras de raíces según los objetivos específicos de la investigación.El trigo y el maíz alcanzaron una germinación del 100 % en GNOVA, mientras que en el sistema de bolsas el trigo alcanzó una germinación del 67 % y el maíz del 75 % a las dos semanas. El trigo cultivado en GNOVA alcanzó la fase de crecimiento Zadok 13, mientras que el trigo cultivado en el sistema de bolsas permaneció en la fase de crecimiento Zadok 11. A la semana 5, el trigo en GNOVA alcanzó la fase de crecimiento Zadok 21, indicada por la aparición de hijuelos, mientras que en el sistema de bolsas no se observaron hijuelos y las plantas permanecieron en la fase de crecimiento Zadok 13. Después de 12 semanas de crecimiento en GNOVA, las plantas de trigo mostraron un mayor número de hojas cloróticas y el cilindro de vidrio estaba lleno de biomasa vegetal. Cuando las plantas de trigo se cultivaron dos semanas adicionales en GNOVA, no hubo un aumento notable en la biomasa. El crecimiento del maíz se evaluó en GNOVA durante cuatro semanas y se comparó con el maíz cultivado en bolsas. La biomasa fresca del maíz cultivado en GNOVA aumentó un 593 % en relación con la del maíz cultivado en el sistema de bolsas. El maíz cultivado en GNOVA presentó una longitud de brote y raíz significativamente mayor que el maíz cultivado en el sistema de bolsas.Este protocolo permite a los investigadores estudiar las interacciones planta-microbio en condiciones controladas y establecer la causalidad entre los efectores microbianos y las respuestas de la planta. El aspecto más difícil de este protocolo es el manejo cuidadoso de las líneas de riego para mantener la esterilidad. En estudios futuros se puede combinar este sistema con comunidades microbianas sintéticas para identificar efectores que promuevan el crecimiento de las plantas e investigar los mecanismos de ensamblaje de comunidades microbianas.

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Investigación

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