Un dispositivo milifluido de cultivo continuo para el estudio de Escherichia coli bajo condiciones de nutrientes bajos y fluctuantes

Mi investigación se centra en examinar cómo las bacterias se adaptan fisiológicamente a condiciones de nutrientes bajos y fluctuantes típicas de los entornos naturales. Los sistemas de cultivo convencionales replican poco condiciones de nutrientes dinámicos, mientras que nuestro sistema permite el cultivo bajo estas condiciones ambientales relevantes. Prepara el cultivo nocturno el día antes del experimento.

Prepara un precultivo añadiendo seis microlitros del cultivo nocturno a un tubo que contenga seis mililitros de medio definido completo rico, o RDM. Divide la mezcla por igual en dos tubos de cultivo de 15 mililitros y etiquétalos como A y B. Incuba ambos tubos a 37 grados Celsius, agitando a 200 RPM. Monitorizar la densidad óptica a 600 nanómetros usando el tubo B y no proceder hasta que la densidad óptica alcance aproximadamente 0,5.

Durante la incubación, prepara el medio de baja RDM y asigna el volumen total entre botellas para diferentes momentos de tiempo. Luego sella cada botella con tapones que tienen tres tubos. Conecta el tercer tubo de silicona más ancho a un filtro de ventilación de 0,2 micrómetros para un intercambio de aire estéril.

Acopla un extremo de cada tubo peristáltico equipado con conectores macho Luer lock a los tubos de silicona de menor diámetro. Deje la cubierta de papel de aluminio sobre el conector de bloqueo Luer macho libre en el otro extremo de los tubos peristálticos hasta que comience el experimento para evitar la contaminación. Coloca las botellas y la bomba peristáltica en una incubadora ajustada a 37 grados Celsius.

Fije todos los tubos peristálticos en los canales de la misma cabeza de bomba, asegurando caudales idénticos en todos los filtros. Diluir el precultivo en una proporción de uno a diez añadiendo 600 microlitros de cultivo en un tubo que contenga 5,4 mililitros de Low RDM. Utilizando una pipeta de un mililitro, introduce un mililitro de cultivo diluido en cada uno de los seis filtros de polivinilideno fluoruro de 0,45 micrómetros, o PVDF.

Después de enjuagar las válvulas antirretorno unidireccionales con agua ultrapura autoclavada, colócalas en cada extremo de los filtros. Quita las tapas de papel de aluminio de las conexiones de tubos. Conecta cada filtro a las conexiones peristálticas de la tubería.

Ajusta el caudal a dos mililitros por minuto en la bomba peristáltica. Coloca un recipiente de residuos debajo de los filtros para recoger el flujo y comienza el flujo. Tras dos horas, desenchufa uno de los filtros conectados a la botella de un litro, desenrosca las válvulas de retención unidireccional y coloca el filtro en un tubo de centrífuga de 50 mililitros con la entrada orientada hacia abajo.

Centrifuga a 2.000 G durante dos minutos. Usando un cortador esterilizado, aplica una presión suave en el extremo de salida de la carcasa de plástico para abrir el filtro. Libera el cilindro interior y descarta la sección que contiene la membrana.

Enjuaga las paredes internas de la carcasa del filtro con el medio de cultivo recogido. Mide el volumen total recogido usando una pipeta sorológica de cinco mililitros. Toma tres alicotas de 100 microlitros de la muestra y figílalas con glutaraldehído hasta una concentración final del 1,5%. Desconecta los filtros correspondientes en los siguientes momentos y repite el procedimiento de recogida.

Etiqueta las muestras recogidas según sus respectivos momentos temporales. Etiqueta las muestras con el colorante de ADN fluorescente y cuenta las células usando citometría de flujo. Con el tiempo, los 10 registros de celdas transformadas siguieron trayectorias lineales, indicando un crecimiento exponencial en todas las condiciones.

Las tasas de crecimiento fueron aproximadamente de 0,88 por hora para la condición de 0,5% de RDM, 0,64 por hora para la condición del 0,25% y 0,18 por hora para la condición del 0,01%. El recuento celular alcanzó hasta mil millones de células por muestra, demostrando que el dispositivo de cultivo continuo milifluido, o MCCD, soporta tanto un crecimiento exponencial como un alto rendimiento de biomasa en concentraciones de nutrientes nanomolares a micromolares. Las células cultivadas en 0,5% de RDM tenían una longitud media de célula mayor que las que crecían en 0,01% de RDM.

El principal desafío durante el cultivo bajo en nutrientes es mantener densidades celulares adecuadas para evitar obstrucciones, acumulación de presión y agotamiento de nutrientes. Siguiendo este procedimiento, las células pueden ser recolectadas para otros análisis posteriores, incluyendo proteómica, metabolómica y otros enfoques ómicos. Estudios futuros pueden investigar la adaptación microbiana a la limitación y fluctuaciones de nutrientes integrando este protocolo con un análisis ómico cuantitativo.