Perfilado lisosomal con LysoTracker para la evaluación cuantitativa de la senescencia celular en fibroblastos humanos

Estudiamos la senescencia celular y su caracterización, centrándonos en cómo características como los cambios lisosomales pueden servir como marcadores de senescencia. Los marcadores de senescencia convencionales suelen ser basados en puntos finales y binarios, mientras que la imagen de células vivas puede leer la senescencia como una señal cuantitativa continua a través de condiciones. Para empezar, sembra fibroblastos IMR-90 en una placa de 24 pozos e incubalos a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al 5% hasta que formen una monocapa subconfluente.

Registra la densidad de siembra y el tiempo entre el placado y la tinción lisosomal de cada experimento. Calienta todo el medio de cultivo a 37 grados Celsius. Prepara una solución de trabajo LysoTracker Deep Red de 75 nanomolares en el medio y protégela de la luz.

Mezcla la solución de trabajo mediante una inversión suave. Selecciona cohortes de fibroblastos IMR-90 presenescentes y senescentes emparejadas, preparadas mediante un método definido de inducción por senescencia. Confirma el fenotipo senescente monitorizando las características de crecimiento y la morfología.

Aspira el medio gastado de cada pozo. Añade suavemente la solución de trabajo LysoTracker a lo largo de la pared de cada pozo, evitando perturbaciones en la monocapa. Incuba las células con LysoTracker durante 30 minutos a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.

Durante los últimos 10 minutos de incubación con LysoTracker, añade Hoechst 33342 directamente a los pozos en la concentración de trabajo recomendada por el fabricante y mezcla meciéndola suavemente. Retira el medio de tinción al final de la incubación y enjuaga las células una vez con PBS precalentado para reducir la fluorescencia de fondo. Inmediatamente después del enjuague, añade un medio de cultivo rojo sin fenol previamente calentado.

Proceder directamente a la imagen de células vivas, manteniendo el tiempo entre el intercambio de búfer y la adquisición de datos consistente en todos los pozos. Etiqueta los pozos paralelos en la placa de cultivo para la tinción de beta-galactosidasa y así comparar células altamente senescentes con los controles presenescentes. Imagen completa de células vivas para los pozos de validación antes de la fijación.

Registra las coordenadas de la etapa durante la imagen en tiempo real para reubicar los mismos campos tras la fijación. Añadir la solución de fijación del kit de tinción de beta-galactosidasa para senescencia que contiene 2% de formaldehído y 0,2% de glutaraldehído a las células. Cubre el plato con la tapa y incuba durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente.

Quita el fijador y enjuaga los pozos dos veces con PBS. Luego añade la solución de tinción de beta-galactosidasa que contiene el sustrato X-gal a pH 6 en cada pozo. Sella la placa con parafilm para limitar la evaporación durante la incubación y coloca la placa en una incubadora seca a 37 grados Celsius sin dióxido de carbono durante 12 a 16 horas.

Tras la fijación y tinción, colocar la placa en el escenario del microscopio y reubicar los mismos campos de imagen usando las coordenadas registradas del escenario. Inspecciona los pozos bajo un microscopio de campo claro y documenta el patrón de tinción. Adquirir imágenes representativas para cada condición y determinar la fracción de células positivas a beta-galactosidasa asociadas a la senescencia por pozo.

Las células senescentes mostraron regiones brillantes y espacialmente expandidas con lisosomas paranucleares, mientras que los controles presenescentes mostraron una señal global más baja con estructuras puntuales discretas. Las condiciones senescentes mostraron una mayor proporción de células beta-gal positivas que los controles presenescentes. Se observó una fuerte correlación entre la intensidad de LysoTracker y el área beta-gal positiva asociada a la senescencia en los pozos replicados.

La intensidad media de LysoTracker dentro de la máscara positiva fue mayor en cultivos seniscentes que en culturas presenescentes, lo que la convierte en el discriminador a nivel de campo más robusto entre ambas condiciones. La intensidad integrada de LysoTracker por núcleo también fue mayor en cultivos seniscentes en el campo representativo mostrado. Este protocolo permite a los investigadores medir la remodelación lisosomal en células vivas, proporcionando una lectura cuantificable de una sola célula de la carga y progresión de la senescencia.

Es importante mantener la coloración y la configuración de imagen idénticas en todos los pozos, ya que las comparaciones de intensidad solo son válidas dentro de una sesión. Estudios futuros pueden extender este procedimiento a modelos tridimensionales, tipos celulares adicionales y validación a través de diferentes sistemas y flujos de trabajo de microscopio.