Name: Perfilado lisosomal con LysoTracker para la evaluación cuantitativa de la senescencia celular en fibroblastos humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-17T12:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Aprende a cuantificar la remodelación lisosomal en fibroblastos humanos IMR-90 mediante LysoTracker Deep Red como marcador indirecto de senescencia celular. Este protocolo de imagen en células vivas ofrece una lectura cuantitativa continua del estado senescente.

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<table><tbody><tr><td>24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229124</td><td>Cualquier placa de cultivo multi-pocillo de fondo transparente compatible con imágenes de fluorescencia de células vivas (por ejemplo, placas de poliestireno TC-tratadas de 6, 12 o 24 pocillos; se pueden preferir placas de fondo de vidrio para imágenes de mayor resolución).</td></tr><tr><td>Beta-galactosidase staining kit (ensayo de senescencia)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9860</td><td>Cualquier kit comercial de SA-β-galactosidasa con tampón de tinción verificado a pH 6.0. Para referencia, la solución de fijación contiene formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0.2% en PBS, y la solución de tinción contiene 1 mg/mL de X-gal en DMF, citrato/fosfato 40 mM pH 6.0, 5 mM de ferrocianuro de potasio, 5 mM de ferricianuro de potasio, 150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2.</td></tr><tr><td>BioRender (software de ilustración científica)</td><td>BioRender</td><td>N/A &mdash; aplicación web</td><td>Utilizado para crear figuras esquemáticas (Figuras 1&ndash;3). https://www.biorender.com</td></tr><tr><td>Carbon dioxide gas (CO2), compressed cylinder</td><td>Airgas (or similar supplier)</td><td>N/A</td><td>CO2 de grado médico utilizado para mantener una atmósfera al 5% en el incubador de cultivo celular y en la cámara de imagen en el escenario.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS), heat-inactivated</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10082147</td><td>Cualquier FBS de grado para cultivo celular, inactivado térmicamente a 56 &deg;C; se utiliza al 10% v/v en medio de cultivo completo.</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope with live-cell capability</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF7000</td><td>Cualquier microscopio de fluorescencia de campo amplio o confocal con control de temperatura y CO2 para células vivas, juegos de filtros para canales de lejano rojo (excitación ~647 nm / emisión ~670 nm) y DAPI/Hoechst (excitación ~405 nm / emisión ~460 nm), y un objetivo de 20&times;-40&times; con NA suficiente para resolver características lisosomales. Se utilizó el sistema de imagen EVOS M7000 en este estudio.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 nuclear stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Tinte de ADN permeable a las células para tinción nuclear de células vivas (fluorescencia azul, excitación ~405 nm). No intercambiable con DAPI, que no es permeable a las células en condiciones fisiológicas.</td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Python Software Foundation</td><td>N/A</td><td>Cualquier entorno de computación científica que admita la segmentación del núcleo, la expansión de la región del núcleo a la célula, el umbral de intensidad y estadísticas básicas de imágenes (por ejemplo, Python con scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). El pipeline SenTrack (ver Archivo Suplementario S1) se desarrolló para este estudio.</td></tr><tr><td>IMR-90 human lung fibroblasts (cell line)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Línea celular de fibroblastos diploides de pulmón fetal humano normal utilizada para modelar la senescencia replicativa; se puede sustituir por cualquier línea de fibroblastos humano caracterizada de manera similar.</td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>L12492</td><td>Tinte fluorescente acidótropo para tinción de orgánulos ácidos de células vivas; se suministra como stock de 1 mM en DMSO. La concentración de trabajo es de 75 nM en medio de cultivo celular preparado.  La emisión en lejano rojo (ex 647 nm / em 668 nm) minimiza la superposición con la autofluorescencia de la lipofuscinas pero no la elimina.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11-095-080</td><td>Medio de cultivo basal para fibroblastos IMR-90; se complementa con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Se puede sustituir por cualquier formulación estándar de medio esencial mínimo de Eagle con sales de Earle y L-glutamina.</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin solution (100&times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15140122</td><td>Suplemento antibiótico para medio de cultivo completo; se usa al 1% v/v (concentración final 100 U/mL de penicilina, 100 &mu;g/mL de estreptomicina). Se puede sustituir por cualquier solución estándar de pen-estrep.</td></tr><tr><td>Phenol red-free imaging medium</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>A1896701</td><td>DMEM o HBSS libres de fenol rojo utilizados para la imagen de células vivas para reducir la fluorescencia de fondo durante la adquisición. FluoroBrite DMEM es una opción comúnmente utilizada; se puede sustituir por cualquier tampón de imagen libre de fenol rojo complementado con 10% de FBS.</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 (1&times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td>Tampon isotónico para lavado celular y dilución de reactivos; se puede sustituir por cualquier PBS 1&times; estéril a pH 7.4.</td></tr><tr><td>SenTrackLite v0.5.0 (software)</td><td>Open-Source (Estrada / Melendez Lab)</td><td>v0.5.0</td><td>Aplicación Python / Tkinter de archivo único de código abierto para el análisis de imágenes de senescencia lisosomal. Distribuido como Archivo Suplementario S1. Archivado en Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. Licencia MIT. Fuente: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack</td></tr><tr><td>Stage-top environmental chamber</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMC2000</td><td>Cámara ambiental para imagen de células vivas en microscopio con control de temperatura (37 &deg;C) y CO2 (5%). Se utilizó el EVOS Onstage Incubator en este estudio; se puede sustituir por cualquier incubadora equivalente en el escenario.</td></tr></tbody></table>

perfilado lisosomal con lysotracker para la evaluación cuantitativa de la senescencia celular en fibroblastos humanos

Lysosomal Profiling With LysoTracker For Quantitative Assessment of Cellular Senescence In Human Fibroblasts

Perfilado lisosomal con LysoTracker para la evaluación cuantitativa de la senescencia celular en fibroblastos humanos

Cellular senescence is a stable cell-cycle arrest state associated with characteristic phenotypes, including enlarged cell morphology, altered secretory ...

lysosomal-profiling-with-lysotracker-for-quantitative-assessment

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video ilustra un ensayo basado en citometría de flujo para cuantificar células cancerosas senescentes inducidas por la terapia con marcadores de senescencia duales. La detección y cuantificación de células senescentes implica el uso de un sustrato de β-galactosidasa. El sustrato es escindido por la β-galactosidasa lisosomal activa dentro de las células senescentes, produciendo un producto fluorescente que, junto con gránulos de lipofuscina autofluorescente, marca las células cancerosas...

Cuantificación basada en citometría de flujo de células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Si senescencia previene o promueve la tumorigénesis sigue siendo controvertido. Como los fármacos quimioterapéuticos pueden inducir a las células cancerosas a la senescencia, el estudio de la senescencia es esencial para proponer nuevas terapias. Sin embargo, el ensayo de β-galactosidasa estándar y ampliamente utilizado presenta importantes inconvenientes. Proponemos aquí un ensayo de citometría basada rápido y sensible para cuantificar el flujo de la senescencia.

Un método sensible para cuantificar las células cancerosas senescentes

La senescencia celular, el estado irreversible de la detención del ciclo celular, puede ser inducida por diferentes tipos de estrés celular. A continuación, describimos protocolos para inducir senescencia y métodos celular para evaluar marcadores de senescencia.

Técnicas para inducir la senescencia celular y cuantificar

Aquí, discutimos una serie de protocolos para la inducción y validación de senescencia celular en células cultivadas. Nos enfocamos en diferentes estímulos de inducción de senescencia y describir la cuantificación de los marcadores comunes asociados a senescencia. Proporcionamos detalles técnicos utilizando fibroblastos como modelo, pero los protocolos se adaptan a varios modelos de celulares.

Inducción y validación de senescencia celular en las células humanas primarias

ROS intracelular se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la inducción de senescencia celular. Aquí, describimos un análisis sensible para cuantificar los niveles ROS durante la senescencia celular. También ofrecemos protocolos para evaluar el fenotipo secretor asociados a senescencia, que supuestamente contribuye a diferentes disfunciones relacionadas con la edad.

Una medida cuantitativa de especies reactivas de oxígeno y senescencia asociada a fenotipo secretor en fibroblastos humanos normales durante la senescencia inducida por el oncogén

La senescencia celular es el factor clave en el desarrollo de patologías crónicas relacionadas con la edad. La identificación de las terapias que se dirigen a las células senescentes son prometedoras para extender el envejecimiento saludable. Aquí, presentamos un nuevo ensayo para la identificación de senoterapéuticos basado en la medición de la actividad de senescencia asociada a la galactosidasa en células individuales.

Ensayo de cribado basado en sA-Galactosidasa para la identificación de medicamentos senoterapéuticos

Este protocolo describe el flujo de trabajo para el etiquetado metabólico de células senescentes y no en división con SILAC pulsado, análisis de espectrometría de masas no dirigido y un cálculo simplificado de las vidas medias de las proteínas.

Medición de las tasas de recambio de proteínas en células cultivadas senescentes y no divisorias con etiquetado metabólico y espectrometría de masas

Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Se presenta un protocolo para la cuantificación citométrica de flujo fluorescente de células cancerosas senescentes inducidas por fármacos de quimioterapia en cultivo celular o en modelos tumorales murinos. Los procedimientos opcionales incluyen la co-inmunotinción, la fijación de muestras para facilitar el análisis de lotes grandes o puntos de tiempo, y el enriquecimiento de células senescentes viables mediante clasificación citométrica de flujo.

Sonda de β-galactosidasa asociada a senescencia fluorescente de color rojo lejano para la identificación y el enriquecimiento de células tumorales senescentes mediante citometría de flujo

La inmunofluorescencia multiplexada permite el marcado secuencial de múltiples marcadores de anticuerpos dentro de una sola sección tisular para apoyar el análisis espacial de la arquitectura tisular y las poblaciones celulares. Aquí se presenta un flujo de trabajo para la detección multiplex de marcadores estructurales, estructural e inmunitarios asociados a la senescencia, que incluye preparación manual y automatizada de portaobjetos, imágenes iterativas y análisis de células individuales...

Ensayo de inmunofluorescencia multiplexado para la evaluación espacial de marcadores de senescencia in vivo

Este protocolo presenta microscopía confocal de luz reflejada para la detección objetiva y unicelular de la actividad beta-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) en la fracción vascular estromal aislada del tejido adiposo humano. El método es compatible con inmunocitoquímica, incorpora controles de pH para la evaluación cuantitativa y, además, ofrece una alternativa más sensible y menos subjetiva a la tinción convencional de SA-β-gal.

Detección de senescencia usando luz reflejada en la fracción vascular estromal adiposa

Aprende a cuantificar la remodelación lisosomal en fibroblastos humanos IMR-90 mediante LysoTracker Deep Red como marcador indirecto de senescencia celular. Este protocolo de imagen en células vivas ofrece una lectura cuantitativa continua del estado senescente.

Perfilado lisosomal con LysoTracker para la evaluación cuantitativa de la senescencia celular en fibroblastos humanos

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