Identificación de posibles candidatos anti-TB: Guía paso a paso para la síntesis, determinación de la CIM y evaluación de citotoxicidad en células mamíferas

El enfoque de nuestra investigación es el desarrollo y validación de nuevos candidatos a fármacos antituberculosos destinados a avanzar en estrategias terapéuticas. La cadena de cribado fenotípico preventivo puede utilizarse en la búsqueda de nuevos fármacos contra cepas de Mycobacterium tuberculosis. Para empezar, reúne los reactivos necesarios y procede a preparar la mezcla de reacción usando las proporciones presentadas.

Remueve la mezcla de reacción a 85 grados Celsius durante 16 horas. Utiliza un evaporador rotativo para eliminar el disolvente. Añade aproximadamente 20 mililitros de solución de bicarbonato de sodio saturado al residuo.

Filtra esta suspensión usando un papel filtro de celulosa cualitativa de 11 micrómetros para recoger los sólidos residuales. Disuelva los sólidos residuales en 50 mililitros de cloroformo. Utiliza un embudo separador para enjuagar la solución de cloroformo con 15 mililitros de agua tres veces.

Quitando la capa de agua cada vez. Añade sulfato de sodio anhidro a la fase orgánica para eliminar el agua residual y sécala. Tras evaporar el disolvente, lava el sólido verde resultante cuatro veces con 10 mililitros de hexano caliente a aproximadamente 50 grados Celsius.

A un miligramo de Compuesto 6, añade un mililitro de una mezcla uno a uno de acetonitrilo y metanol para preparar una solución de stock. Diluye la solución original a 0,5 miligramos por mililitro y filúrala antes del análisis. Carga la muestra en el sistema HPLC.

Utiliza software de adquisición de datos de cromatografía para adquirir y procesar los datos. Configura el método cromatográfico para usar una columna C18 de fase inversa de 250 por 4,6 milímetros y tamaño de partícula de cinco micrómetros. Ajusta el caudal a 1,5 mililitros por minuto y la detección UV a 254 nanómetros.

Establece un gradiente presentado con los cambios programados de composición de fase móvil. Transfiere aproximadamente entre 15 y 20 miligramos del Compuesto 6 a un tubo de resonancia magnética nuclear o RMN. Disuelve en un volumen adecuado de DMSOD6.

Una vez que los parámetros de adquisición están establecidos tal y como se presentan, adquiere el espectro RMN de protones usando una secuencia de pulsos estándar. Ajustar los parámetros de adquisición. Inicia el espectro de RMN de protones y carbono 13 e informa de los cambios químicos en partes por millón.

Visualiza y procesa los datos de RMN con el archivo libre de decaimiento por inducción obtenido del experimento. Para la purificación basada en cromatografía del Compuesto 6, se emplea una columna con gel de sílice. Carga el crudo compuesto 6 sobre la columna.

Eluye el compuesto y recoge fracciones. Monitoriza las fracciones mediante cromatografía de capa fina y combina las fracciones que contienen el producto puro. Añadir 100 microlitros de caldo 7H9 complementado con dextrosa al 10% de albúmina catalasa o ADC a la columna 12 de la placa de 96 pozos.

Luego transfiere 100 microlitros de caldo 7H9 que contiene 10% de ADC y 5% de DMSO a la columna 11. Y luego, secuencialmente, de la columna nueve a la una. Añade 200 microlitros de la solución compuesta a la columna 10, asignando una fila por compuesto.

Pipetear 100 microlitros de la solución compuesta al doble de la concentración de prueba más alta hasta la columna 12 de la placa de 96 pozos. Transfiere 100 microlitros de la columna 10 a la columna nueve y mezcla bien pipeteando para comenzar una dilución doble de cereales. Continúa la dilución en serie secuencialmente hasta la columna uno.

Añade 100 microlitros de la suspensión bacteriana de Mycobacterium tuberculosis secuencialmente desde la columna 11 hasta la columna uno y cubre la placa. Sella la placa con parafilm e incuba a 37 grados Celsius durante siete días. A continuación, añade 60 microlitros de solución de resazurina al 0,01% en cada pozo de la placa y cúbrelo.

Sella la placa con parafilm e incuba a 37 grados Celsius durante 48 horas. Luego comprueba el cambio de color de azul a rosa. Prepara una solución operativa de 0,5 miligramos por mililitro MTT en DMEM sin suero.

Obtén células Vero y HEPG2 tratadas con el Compuesto 6 durante 48 horas e inspecciónalas para evaluar los efectos del tratamiento. Aspira el medio de las placas y añade 50 microlitros de la solución de trabajo MTT a cada pozo bajo condiciones de poca luz ambiental. Tras una incubación de tres horas, añadir 100 microlitros de DMSO a cada pozo para disolver los cristales de formazan bajo condiciones de poca luz ambiente.

Coloca la placa sobre un agitador orbital a 100 RPM durante 15 minutos manteniéndola protegida de la luz. Inspecciona los pozos de control para confirmar la disolución completa de cristales. Pon la placa en un lector de microplacas.

Ajusta la longitud de onda de referencia de 630 a 690 nanómetros y comprueba la absorbancia en 570 nanómetros. Prepara una solución de trabajo roja neutra de 40 microgramos por mililitro en DMEM sin suero. Luego prepara la solución de desorción rojo neutra que contiene 1% de ácido acético glacial, 49% de etanol y 50% de agua ultrapura en volumen.

Una vez evaluado el efecto del Compuesto 6 sobre las células Vero y HEPG2, se retira el medio y se añaden 100 microlitros de la solución de trabajo neutra roja filtrada a cada pozo. Incuba la placa durante dos horas a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono. Después de eliminar la solución roja neutra de trabajo, enjuaga cada pozo una vez con 150 microlitros de PBS estéril.

Añade 150 microlitros de la solución de desorción roja neutra a cada pozo. Coloca la placa sobre un agitador orbital a 150 RPM durante 15 minutos para extraer el tinte. Revisa los pozos de control para confirmar la extracción completa del tinte.

Lee la absorbancia a 540 nanómetros con un lector de microplacas. El cromatografía HPLC mostró que el Compuesto 6 tuvo un tiempo de retención de 14,11 minutos y una pureza del 99%. El espectro RMN de protones mostró señales características para la mitad piperidina entre 1,50 y 3,13 partes por millón. Un singlete de metilo a 2,38 partes por millón.

Y señales aromáticas que incluyen dobletes a 6,97 y 7,17 partes por millón y un multiplete a 7,63 a 7,75 partes por millón. El espectro de RMN de carbono 13 mostró una señal de metilcarbono en 23,81 partes por millón, y señales relacionadas con la piperidina entre 24,85 y 49,70 partes por millón. La placa MTT mostró un claro gradiente de color entre las concentraciones de compuestos, lo que indica que la citotoxicidad era mayor en concentraciones altas de compuestos en pozos translúcidos y más baja en concentraciones bajas en pozos púrpura profundo.

La placa de captación roja neutra mostró un claro gradiente de color entre concentraciones de compuestos, lo que indica que la citotoxicidad era mayor en concentraciones altas de compuestos en pozos translúcidos y más baja en concentraciones bajas en pozos rosa profundo. Este protocolo representa una vía para el desarrollo de candidatos a fármacos contra la tuberculosis basados en el cribado fenotípico. Es importante considerar y evaluar la baja solubilidad de los compuestos sintetizados al aplicar el protocolo.

Esta investigación puede servir de base para futuros estudios de biodisponibilidad, infección por macrófagos y in vivo.