Name: Un método para adaptar Euglena gracilis a sustratos basados en yuca para cultivo heterotrófico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Aprende a adaptar Euglena gracilis a sustratos de yuca para cultivo heterotrófico mediante una estrategia de exposición gradual. Este método permite valorizar residuos agrícolas y producir biomasa rica en proteínas de forma sostenible.

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<table><tbody><tr><td>Autoclave - 533LS Steam Esterilizador</td><td>Getinge</td><td>533LS</td><td>Esterilización por vapor de medios de yuca. Esterilice los medios usando el ciclo líquido.</td></tr><tr><td>Bright-Line&trade; Hemacitómetro reemplazo cubreobjetos</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR723015- 100EA</td><td>Cubreobjetos gruesos especializados diseñados para uso en hemacitómetro.</td></tr><tr><td>Pulpa seca de yuca </td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Sustrato de yuca proporcionado</td></tr><tr><td>Pellets de yuca</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Sustrato de yuca proporcionado</td></tr><tr><td>Pellas de yuca</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Sustrato de yuca proporcionado</td></tr><tr><td>Sustrato de yuca (garri)</td><td>Proveedor local</td><td>N/A</td><td>Garri derivado de la yuca fuente de carbono preparado con agua desionizada.</td></tr><tr><td>Centrífuga Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifugadora</td><td>Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifugadora</td><td>75004241</td><td>Capaz de &ge;3,500 &times; g, usada para recolección de biomasa.</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Ej. Axygen (A Marca Corning)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C-S</td><td>Estéreo, mínimo 1.5 mL de volumen</td></tr><tr><td>Agua limpia Ej. UltraPure&trade; Agua desionizada libre de DNasa/RNasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977035</td><td>Desionizada o destilada. Usada para la preparación de medios</td></tr><tr><td>Microscopio de luz compuesta</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Microscopio compuesto estándar adecuado para observación y conteo rutinario de células.</td></tr><tr><td>Prueba de cianuro Tiras, colorimétrico. CN- 10-30 mg/L</td><td>MQuant</td><td>110044</td><td>Detección semi-cuantitativa de cianuro. Elimínelas como desperdicios peligrosos</td></tr><tr><td>Barquilla de pesaje estándar estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td>Usada para pesar sustratos de yuca y biomasa seca.</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (linaje adaptado )</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Cepa adaptada a la yuca generada en este estudio</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (tipo salvaje)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Cepas de referencia no adaptadas. Mantenga las mismas condiciones estándar.</td></tr><tr><td>Componentes del medio de crecimiento de Euglena</td><td>Varios</td><td>N/A</td><td>Medio basal de Euglena preparado según formulaciones estándar de laboratorio.</td></tr><tr><td>Secador de congelación FreeZone 6 litros </td><td>Labconco</td><td>70061xxxx</td><td>Usado para la deshidratación de biomasa</td></tr><tr><td>Hemacitómetro con líneas estándar</td><td>Weber Scientific</td><td>NC1587539</td><td>Usado para el conteo manual de células.</td></tr><tr><td>Agitador magnético con placa caliente</td><td>IKA</td><td>N/A</td><td>Opcional; mejora la consistencia durante la preparación de medios y suspensión de sustratos.</td></tr><tr><td>Micropipetas (P20, P200, P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Pipetas de volumen ajustable usadas para transferencias líquidas asépticas.</td></tr><tr><td>Minicentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Opcional; facilita la sedimentación rápida durante la recolección de biomasa.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>Usado para el sellado temporal de matraces o placas cuando no hay disponibles tapas con ventilación.</td></tr><tr><td>Tiras indicadoras de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-520</td><td>Alternativa al medidor de pH para la evaluación cualitativa rápida de los medios de cultivo.</td></tr><tr><td>Medidor de pH con sonda Thermo Scientific Orion Star A211 Medidor de pH de sobremesa</td><td>Thermo Scientific Orion Star A211 Medidor de pH de sobremesa</td><td>13-645-519</td><td>Calibrado antes de su uso. Para medir el pH del sobrenadante del cultivo</td></tr><tr><td>Almacenamiento refrigerado (4&deg;C)</td><td>Frigidaire</td><td>FRT18S6JW7</td><td>Almacenamiento a corto plazo de los medios</td></tr><tr><td>Incubadora de agitación (oscura)</td><td>Thermolyne</td><td>M49235</td><td>Incubadora de agitación orbital capaz de 100&ndash;150 RPM, rango de temperatura 24&ndash;28 &deg;C; usada en condiciones oscuras para apoyar el crecimiento heterotrófico de Euglena.</td></tr><tr><td>Botella de spray (32oz)</td><td>Boardwalk</td><td>BWK03010</td><td>Usada para esterilización en bancada y manejo aséptico rutinario (solución de etanol al 70%)</td></tr><tr><td>Software de hoja de cálculo</td><td>Microsoft Excel</td><td>N/A</td><td>Recolección, organización y análisis de datos</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta estériles</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Puntas estériles y desechables compatibles con pipetas P20, P200 y P1000.</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estériles (5, 10, 25 mL)</td><td>Corning</td><td>N/A</td><td>Pipetas estériles envueltas individualmente, usadas para transferencias y muestreo de cultivos.</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripán 0.4%, líquida, estéril filtrada, adecuada para cultivo celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Colorante vital usado para la evaluación de viabilidad celular mediante el ensayo de exclusión de azul de tripán.</td></tr><tr><td>Tubos para recolección de muestras (50 mL)</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>Para muestras de pH y cianuro</td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer con tapa de ventilación (250&ndash;500 mL)</td><td>Matraces Erlenmeyer de policarbonato Corning® de 250 mL con tapa de ventilación</td><td>431144</td><td>Matraces Erlenmeyer de policarbonato con tapas ventiladas; autoclavables; usados tanto para cultivos líquidos estériles como no estériles.</td></tr><tr><td>Contenedor de desechos</td><td>Varios - en cumplimiento con los estándares de laboratorio establecidos</td><td>N/A</td><td>Bolsas de autoclave y contenedores de desechos de material punzante o vidrio para eliminación conforme a la bioseguridad.</td></tr></tbody></table>

un método para adaptar euglena gracilis a sustratos basados en yuca para cultivo heterotrófico

A Method for Adapting Euglena gracilis to Cassava-Based Substrates for Heterotrophic Cultivation

Los siguientes resultados representativos ilustran los resultados esperados cuando se aplica con éxito el protocolo descrito, así como el rango de resultados observados bajo condiciones subóptimas. Los datos representativos correspondientes a estos resultados se muestran en la Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7. En conjunto, estos resultados proporcionan orientación práctica para interpretar la dinámica del crecimiento, la viabilidad, la morfología y los resultados proteicos al adaptar E. gracilis a sustratos basados en yuca bajo condiciones de cultivo heterotróficas y completamente oscuras. Además, estos resultados validan los resultados biológicos clave del protocolo, incluyendo adaptación exitosa, crecimiento sostenido, alta viabilidad, morfología estable, rendimiento consistente entre sustratos y producción medible de proteínas.
A lo largo de los experimentos, se utilizaron tres réplicas por tratamiento (todos los tipos de medios de yuca). Reconocemos que el número de replicaciones depende de la discreción y las limitaciones logísticas de cualquier grupo que siga los protocolos mencionados. La aplicación exitosa de este protocolo resulta en un crecimiento heterotrófico sostenido de E. gracilis en medios basados en garri bajo condiciones completamente oscuras. Los resultados positivos se caracterizan por trayectorias de crecimiento suaves y sigmoidales, divergencia limitada entre réplicas y densidades celulares estables en fase tardía. Los rasgos morfológicos que indicaron resultados positivos y se observaron de forma consistente en poblaciones adaptadas incluyeron la redondez celular y las membranas celulares gruesas. En cambio, las células colapsadas no saludables suelen aparecer irregulares, fragmentadas o estructuralmente comprometidas y se asocian con una viabilidad reducida, distinguiéndolas de formas intactas, redondeadas o semi-encistadas observadas en cultivos adaptados. Como referencia, se incluyen imágenes representativas de E. gracilis tipo salvaje que exhibe una morfología alargada característica (Figura 8) para distinguir la estructura celular base de las formas adaptadas o alteradas. Los cultivos cultivados con 30 g de L-1 garri mostraron un mayor crecimiento integrado, medido por el área bajo la curva de crecimiento (AUC), en comparación con concentraciones más bajas, lo que sugiere una utilización más eficiente del sustrato de yuca y una adaptación fisiológica exitosa (Figura 1).
Los resultados subóptimos se observan comúnmente en concentraciones bajas de garri (10–20 g L-1), donde el crecimiento es detectable pero reducido en magnitud y más variable entre réplicas. A concentraciones más altas (40–50 g L-1), los cultivos pueden alcanzar densidades celulares máximas elevadas; sin embargo, estas condiciones muestran frecuentemente estabilización tardía o aumento de la variabilidad temporal (Figura 2).
En experimentos exitosos, la viabilidad celular se mantiene alta durante todo el periodo de cultivo, con solo fluctuaciones menores a mitad del experimento. Los ensayos de exclusión de tripán azul indican que los cultivos mantenidos a 30 g de L-1 garri conservan una alta proporción de células viables (sin colorear) en relación con las no viables (tintadas de azul) en los momentos muestreados (Figura 3). Las desviaciones respecto a este patrón, incluyendo un aumento de la proporción de células teñidas, una motilidad reducida o cambios hacia morfologías redondeadas o colapsadas, pueden indicar condiciones subóptimas y servir como desencadenantes tempranos para la resolución de problemas. Las evaluaciones de viabilidad y morfología se basaron en criterios observacionales consistentes, incluyendo la integridad celular, la motilidad direccional y la prevalencia relativa de formas alargadas frente a redondeadas o colapsadas.
Los resultados subóptimos se caracterizan por reducciones transitorias en la viabilidad, observadas más comúnmente en concentraciones de garri más altas. La recuperación parcial puede observarse en momentos posteriores; sin embargo, estas condiciones muestran una mayor variabilidad en la viabilidad a lo largo del periodo de cultivo (Figura 4). Estos patrones de crecimiento muestran que las concentraciones intermedias de sustrato (por ejemplo, 30 g L-1) proporcionan un equilibrio entre la disponibilidad de nutrientes y el estrés, resultando en un crecimiento más estable. Estas tendencias reflejan el impacto de las condiciones de preprocesamiento y la adaptación por etapas en el rendimiento del cultivo, ya que la exposición gradual a la creciente complejidad del sustrato favorece una mejor estabilidad fisiológica y un comportamiento de crecimiento reproducible. Las concentraciones más bajas limitan la producción de biomasa, mientras que concentraciones más altas conducen a una mayor variabilidad y estabilización retardada.
La evaluación morfológica proporciona un indicador cualitativo del estado de adaptación. Los resultados positivos incluyen la aparición y persistencia de células redondeadas o semi-encistadas con motilidad reducida que permanecen intactas a través de subcultivos repetidos (Figura 5).
En cambio, los cultivos subóptimos, la mayoría asociados con cepas salvajes o adaptaciones en etapas tempranas, presentan transiciones abruptas de células alargadas y móviles a morfologías irregulares o colapsadas que coinciden con una menor estabilidad de crecimiento.
Cuando el protocolo se aplica a sustratos derivados de yuca adicionales, incluyendo pulpa, pellets y peelings, los cultivos adaptados de E. gracilis muestran crecimiento reproducible en múltiples tipos de sustratos. Los resultados positivos se caracterizan por una estabilización más temprana de las curvas de crecimiento y una reducción del declive en etapas avanzadas en comparación con los cultivos de tipo silvestre (Figura 6).
Los resultados subóptimos incluyen un inicio tardío del crecimiento o un aumento de la variabilidad replicada, especialmente en sustratos con mayor heterogeneidad física.
La implementación exitosa del protocolo produce biomasa de E. gracilis con contenido medible de proteína cruda, cuantificado por análisis externos de laboratorio utilizando el método de Combustión (Dumas). Los porcentajes de proteínas observados en cultivos adaptados son comparables a los medidos en cultivos de tipo salvaje, con una mayor producción total de proteínas correspondiente a un aumento de la acumulación de biomasa (Figura 7).
La monitorización de la química del medio apoyó las interacciones cultivo-sustrato durante la adaptación y validó la inclusión de mediciones de pH y cianuro dentro del protocolo. Los valores de pH mostraron cambios graduales a lo largo del tiempo, lo que indica actividad metabólica y utilización de sustratos, con tendencias más estables en cultivos adaptados. Las mediciones con cianuro reforzaron esto aún más, ya que los cultivos adaptados mostraron reducciones en los niveles detectables, mientras que los cultivos salvajes seguían siendo más variables. En conjunto, estos resultados demuestran que estos pasos de monitorización capturan eficazmente los cambios en la química de los medios asociados con la adaptación y apoyan la interpretación del rendimiento cultural. Aunque no se investigaron los mecanismos subyacentes, esto representa un área importante para futuras investigaciones, especialmente para aplicaciones a escala industrial.
El flujo de trabajo de mantenimiento y consolidación a largo plazo apoyó la viabilidad continua de la línea adaptada de Euglena gracilis durante períodos prolongados de cultivo. Los cultivos mantenidos mediante pasos repetidos conservaron consistentemente la motilidad, la morfología característica y un comportamiento de crecimiento estable a lo largo de los ciclos de mantenimiento. Aunque el rendimiento a largo plazo no se evaluó cuantitativamente, estas observaciones proporcionan evidencia representativa de que el linaje adaptado puede mantenerse de forma fiable bajo las condiciones especificadas.
En conjunto, estos resultados confirman que el protocolo de adaptación soporta un crecimiento robusto, viabilidad y producción de biomasa de E. gracilis en sustratos basados en yuca, con un rendimiento consistente y niveles reducidos de cianuro a lo largo del tiempo.
Todas las figuras y tablas se proporcionan como archivos separados y no están incrustadas en el documento manuscrito. Las preferencias de colocación de figuras y tablas se indican dentro del texto del manuscrito mediante notas entre corchetes (por ejemplo, (Figura 1)). Salvo que se especifique lo contrario, todas las cifras y tablas deben aparecer debajo de la sección de Resultados Representativos en la publicación final.
Todas las figuras se envían como archivos individuales, con figuras multipaneladas proporcionadas como una sola imagen combinada. Las imágenes de microscopía incluyen barras de escala en cada panel. Las figuras de datos incluyen ejes etiquetados con unidades de medida definidas, y las barras de error se especifican en las leyendas correspondientes de las figuras.
Todas las tablas se envían como archivos individuales .xls o .xlsx y contienen datos numéricos en bruto o resumidos sin formato decorativo.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Dinámica de crecimiento de E. gracilis cultivada con 10, 20 y 30 gL-1 garri en condiciones completamente oscuras. Las densidades medias de las células se muestran a lo largo del tiempo para cada concentración de sustrato. Las barras de error representan el SEM entre réplicas biológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Rendimiento de crecimiento de E. gracilis a concentraciones elevadas de garri (30–50 g L-1). Las trayectorias de densidad celular ilustran diferencias en la densidad máxima, el momento de estabilización y la variabilidad entre concentraciones más altas en sustratos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Tendencias de viabilidad celular de E. gracilis cultivadas con 30 gL-1 garri medidas mediante exclusión de Trypan Blue. La proporción de celdas viables se muestra a lo largo de los puntos temporales muestreados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Fluctuaciones de viabilidad de E. gracilis cultivadas a concentraciones de garri más altas. Se muestran cambios transitorios en la viabilidad celular a lo largo del periodo experimental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig5.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Morfología representativa de poblaciones adaptadas de E. gracilis . Imágenes representativas de microscopía óptica invertida muestran células redondeadas y semi-encistadas observadas tras la adaptación. Barra de escala = XX μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig6.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6: Rendimiento de crecimiento de E. gracilis adaptado y de tipo salvaje en sustratos derivados de yuca. Se muestran las trayectorias de crecimiento para cultivos adaptados y de tipo salvaje cultivados con múltiples productos de yuca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig7.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 7"> 
Figura 7: Contenido de proteína bruta y producción total de proteínas de biomasa de E. gracilis cultivada en yuca. El contenido de proteínas se cuantificó mediante análisis externos utilizando el método de combustión SGS (Dumas). La producción total de proteínas se muestra junto con la acumulación de biomasa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig8.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 8"> 
Figura 8: Morfología representativa de E. gracilis de tipo salvaje bajo condiciones estándar (aumento de 40X). Imagen representativa de Euglena gracilis sana y no adaptada que muestra una morfología característica alargada bajo microscopía óptica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>

Un método para adaptar Euglena gracilis a sustratos basados en yuca para cultivo heterotrófico

Cassava processing generates nutrient-rich by-products that remain underutilized due to variable composition, cyanogenic compounds, and active microbial ...

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