Expresión específica de las buenas prácticas agrarias en el folículo del pelo usando Ex Vivo transducción viral
17 de marzo de 2008
El folículo piloso es un apéndice de gran complejidad de la piel que contiene una multiplicidad de tipos de células. El folículo se somete a ciclos constantes a lo largo de la vida del organismo, incluyendo el crecimiento y la reabsorción de crecimiento depende de las células madre específicas. La selección del folículo por los genes y las células madre para cambiar sus propiedades, en particular, la naturaleza del cabello es discutido. Sistemas de administración de pelo del folículo se describen, tales como los liposomas y vectores virales para terapia génica. La naturaleza de las células madre del folículo del pelo se trata, en particular, su pluripotencialidad.
El folículo piloso es un apéndice cutáneo complejo formado por seis cilindros concéntricos con varios tipos celulares distintos que producen proteínas altamente especializadas. El ciclo continuo del folículo piloso a través de sus distintas fases de crecimiento hace que este apéndice sea adecuado para la terapia génica dirigida, que podría corregir la calvicie y la pérdida de la pigmentación del cabello. En este video, demostramos un método para la histocultura del cabello, el crecimiento de la piel y la transducción ex vivo de folículos pilosos con proteína verde fluorescente.
Esta técnica de transducción eficiente es útil para seguir la actividad del promotor de diversos genes de interés en varias regiones del folículo durante todo su ciclo de crecimiento. Mi nombre es Robert Hoffman. Soy presidente de Anti-Cancer Inc.
Hoy les vamos a mostrar procedimientos muy potentes para la terapia génica del folículo piloso. Este protocolo comienza con la histocultura de la piel, seguida del tratamiento con colagenasa. Primero se sacrifica al miserable seis días después de la depleción, y se extrae la piel de la espalda a nivel del tejido subcutáneo.
Tras la eliminación de la piel, se retira el tejido subcutáneo. Luego, la piel se enjuaga con PBS sin calcio ni magnesio. En este punto, la piel diseccionada se transfiere al medio tras el enjuague con PBS.
Las muestras de piel se cortan en pequeños trozos de aproximadamente un milímetro cúbico. Una fracción de los especímenes se separa y se cultiva en RPMI 1640 y 10% de suero bovino fetal como controles no tratados. El resto de los especímenes se incuba en dos mg por ml.
Solución de colagenasa. En medio RPMI durante 45 minutos hasta 3,75 horas a 37 grados; los especímenes digeridos se lavan luego en PBS sin calcio ni magnesio. Las culturas histológicas pueden infectarse con virus para la transducción de GFP. Ahora que la colagenasa ha hecho que los folículos pilosos sean más accesibles al virus, con el fin de inducir los folículos pilosos.
Para expresar GFP, primero se infectan con adenovirus. Luego se añade un plásmido que porta GFP a la piel tratada con colagenasa. Los histocultivos se realizan con entre 2,4 millones y 5 mil millones de unidades formadoras de placas por mililitro.
Tras la adición del virus, se colocan ahora en el incubador durante una a seis horas tras la transducción viral de GFP en cultivos histológicos de piel y aproximadamente 24 horas después de la recolección, los especímenes pueden injertarse en ratones desnudos o C 57 negro seis. La expresión de GFP puede evaluarse entonces mediante microscopía de fluorescencia realizada ya sea en cultivos histológicos o visualizada in vivo en piel injertada. Con el fin de determinar la eficiencia de la transducción de GFP, se determina el número total de folículos pilosos y los folículos pilosos positivos para GFP mediante microscopía de campo claro y microscopía de fluorescencia.
Se analizan cinco campos microscópicos elegidos al azar que cubren un área de 0,581 milímetros cuadrados. Para la expresión de GFP, se cuentan al menos 500 pelos por espécimen para calcular el porcentaje de folículos pilosos positivos para GFP. Los folículos pilosos en los que se visualiza GFP en cualquier parte del bulbo piloso o del tallo se califican como positivos para GFP.
Acabamos de mostrarle un método altamente eficiente para la transducción de GFP y folículos pilosos, que será extremadamente útil para la terapia génica. Tales conocimientos tienen importancia clínica porque tienen implicaciones para curar la alopecia o la calvicie, prevenir la alopecia inducida por quimioterapia y modificar de forma permanente el color del cabello. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.
Descripción general
El folículo piloso es una apéndice cutáneo complejo que experimenta ciclos continuos, lo que lo convierte en un objetivo para la terapia génica. Este artículo describe métodos de histocultivo y transducción génica en folículos pilosos, que podrían tener implicaciones para el tratamiento de la pérdida de cabello.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Terapia génica
- Dermatología
Antecedentes
- Los folículos pilosos consisten en múltiples tipos celulares y estructuras.
- Ellos pasan por etapas de crecimiento influenciadas por células madre.
- La terapia génica podría potencialmente tratar afecciones como la calvicie.
- Comprender la biología del folículo piloso es crucial para tratamientos efectivos.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método para el cultivo histológico de folículos pilosos.
- Explorar técnicas de transducción génica para folículos pilosos.
- Evaluar la eficiencia de la expresión de GFP en folículos pilosos.
Métodos Utilizados
- Cultivo histológico de muestras de piel seguido de tratamiento con colagenasa.
- Infección de folículos pilosos con adenovirus que portan un plásmido GFP.
- Evaluación de la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia.
- Análisis de la eficiencia de transducción mediante el conteo de folículos pilosos positivos para GFP.
Resultados principales
- Se logró una transducción eficiente de los folículos pilosos con GFP.
- La expresión de GFP puede visualizarse in vivo y en cultivos histológicos.
- El método muestra potencial para aplicaciones en terapia génica.
- Se discutieron las implicaciones para el tratamiento de la alopecia y la modificación del color del cabello.
Conclusiones
- El estudio presenta un método potente para la terapia génica del folículo piloso.
- Comprender la transducción génica puede conducir a avances en el tratamiento de la pérdida del cabello.
- La investigación futura podría centrarse en las aplicaciones clínicas de estas técnicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La transducción viral ex vivo dirigida de folículos pilosos permite una entrega precisa de genes a poblaciones celulares foliculares distintas, apoyando la interrogación funcional de la expresión génica en un tejido complejo y regenerativo. Este enfoque aumenta la confianza predictiva en las estrategias de terapia génica para las líneas de desarrollo en medicina dermatológica y regenerativa, especialmente en casos donde la especificidad por tipo celular y la eficiencia cuantitativa de transducción son fundamentales. Las salidas cuantitativas y la reproducibilidad del método lo posicionan como una herramienta valiosa para la validación temprana de dianas y la investigación traslacional en I+D biofarmacéutica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la validación funcional de dianas génicas en poblaciones definidas de células del folículo piloso.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al permitir el seguimiento espacial y temporal de la expresión génica mediante GFP.
- Facilita la evaluación cuantitativa de la actividad del promotor y la eficiencia de la entrega génica.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona un sistema reproducible ex vivo para evaluar vectores y constructos de entrega génica.
- Genera lecturas estandarizadas y cuantificables de la eficiencia de transducción mediante microscopía de fluorescencia.
- Permite el desarrollo de ensayos para la selección de candidatos de terapia génica dirigidos a la biología de la piel y los folículos pilosos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad en la modelización de trastornos del folículo piloso y terapias regenerativas.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir el injerto in vivo y el monitoreo longitudinal de la expresión génica.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo para programas de terapia génica dirigidos a apéndices cutáneos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de transducción viral ex vivo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica, actuando como puente entre la validación in vitro y la evaluación funcional in vivo de candidatos para terapia génica que tienen como diana la biología del folículo piloso.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir el análisis dirigido de la expresión génica en subpoblaciones del folículo piloso.
- Selección: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles sobre la eficiencia de transducción para orientar la selección de vectores y constructos.
- Análisis: Ofrece mediciones robustas basadas en fluorescencia para comparar condiciones y resultados de la entrega génica.
- Investigación Traducional: Facilita la continuidad preclínica mediante el injerto y la monitorización in vivo de folículos modificados genéticamente.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma escalable y adaptable para evaluar diversas modalidades de terapia génica en modelos de piel y folículo piloso.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas para terapia génica y reduce la ambigüedad mecanicista en tejidos complejos.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de entrega y cuantificación génica para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos y la clasificación de carteras al proporcionar datos cuantitativos de transducción específicos por tipo celular.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de activos de terapia génica dirigidos a indicaciones dermatológicas y regenerativas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de tejidos ex vivo, manejo de vectores virales y microscopía de fluorescencia.
- Exige acceso a infraestructura analítica para imágenes cuantitativas y análisis de datos.
- Necesita la estandarización entre equipos de los procedimientos de procesamiento de tejidos y de los criterios de puntuación para garantizar la reproducibilidad.
- Puede ser necesario adaptar el método para diferentes especies, tipos de folículos pilosos o vectores de entrega génica.
- La eficiencia y especificidad pueden variar según el tipo de vector, la selección del promotor y el estado del tejido.
