Name: Traducción de ARNm in vitro libre de células en lisados de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprende a realizar traducción in vitro libre de células usando lisados de embriones de Drosophila. Este protocolo permite estudiar síntesis de proteínas y control translacional en múltiples especies de mosca.

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<table><tbody><tr><td>Aluminum foil sheet</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td>Standard household aluminum foil; any equivalent commercial brand acceptable.</td></tr><tr><td>Amino acids mixture</td><td>Promega</td><td>L4461</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Apple cider vinegar</td><td>Heinz</td><td>N/A</td><td>Commercial apple cider vinegar (5% acidity); any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Apple or grape fruit juice</td><td>Jumex</td><td>N/A</td><td>Commercial grape juice; or any equivalent commercial brand.</td></tr><tr><td>Bacteriological agar&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9002-18-0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Boric acid (H3BO3)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>BioReAgent, Molecular Biology grade, &ge;99.5%, powder; used for preparation of TBE buffer.</td></tr><tr><td>Cap: Anti reverse cap (ARCA): 3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)G RNA cap structure</td><td>BioLabs</td><td>S1411S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cap: m7G(5')ppp(5')G RNA cap structure analog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cap: Non-functional cap analogue G(5&acute;)ppp(5&acute;)A</td><td>New England Biolabs</td><td>S1406</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Centrifuge Tube (15 mL)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Complete, EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatine phosphokinase from rabbit muscle</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>C-3755</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatine phosphoric acid, disodium salt</td><td>Merck</td><td>1120A47950</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Dehydrated baker&acute;s yeast</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>Commercial active dry yeast; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>97%(NNR)</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster wild-type strain Oregon-R</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USA</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu/index.html ; mutant strains of Drosophila melanogaster, as well as wild-type reference strains of other Drosophila species, such as virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, etc. are also provided by this Stock Center.</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>ACS reagent, 99.4-100.6%, powder; used for preparation of TBE buffer.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>SLBH4583V</td><td>99.5%(titration)</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td><td>Equate</td><td>N/A</td><td>Commercial (~2.5-3.5% hydrogen peroxide solution; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>In vitro transcription mMessage mMachine T7, T3, or SP6 Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1344 and AM1348</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KOAc, also termed KCH3COO</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Several</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lb broth (lennox)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Luciferase assay system</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E1501</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MAXIscript T7, T3, or SP6 in vitro transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1316 and AM1312</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mg(OAc)2, also termed Mg(CH3COO)2</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Several</td><td>N/A</td></tr><tr><td>NaCl (sodium chloride)</td><td>J.T Baker&nbsp;</td><td>B17W53</td><td>ACS Reagent</td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Any company</td><td>N/A</td><td>Sequence-specific.</td></tr><tr><td>Pasive lysis 5X buffer</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pipet Tips</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td>200 microliters yellow tips.</td></tr><tr><td>Pipet Tips</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td>1ml blue tips.</td></tr><tr><td>Pipet Tips&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td>0.5-10 microliters clear tips.</td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>79-09-04</td><td>ACS reagent grade, &ge;99.5%, liquid.</td></tr><tr><td>PYREX&reg; 5 mL Glass Pestle Tissue Grinder</td><td>&nbsp; PYREX&reg;&nbsp;&nbsp;</td><td>7724-5</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAprep spin plasmid miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Rabbit reticulocyte lysate (RRL)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>L4960</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Renilla luciferase (RLuc) assay system</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2820</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNasin ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2111A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNeasy minielute RNA clean up kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>87735 (However, it depends on the molecular size cutoff).</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium hypochlorite (bleach)</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>Commercial bleach (~5-6% NaOCl); any equivalent commercial brand with similar concentration acceptable.</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Merck</td><td>85558</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Stainless steel sieve</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Any commercial supplier.</td></tr><tr><td>Taq plus precision DNA polymerase</td><td>Stratagene</td><td>600211-51</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Transfer ribonucleic acid (tRNA) from bovine liver type XI</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9014-25-9 or R4752</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris (Tris base)</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70145</td><td>Molecular biology grade powder; used for preparation of TBE buffer.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SLBX9437</td><td>Laboratory Grade</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Unflavored gelatin powder</td><td>Knox</td><td>N/A</td><td>Commercial unflavored gelatin powder; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Unrefined cane sugar (piloncillo)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Commercial Mexican unrefined whole cane sugar; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Vector: pBluescript SK or KS (+/-)</td><td>Stratagene</td><td>200301</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Vector: pGEM-T or pGEM-T Easy.&nbsp;</td><td>Promega</td><td>

traducción de arnm in vitro libre de células en lisados de drosophila

Cell-Free In Vitro mRNA Translation In Drosophila Lysates

Traducción de ARNm in vitro libre de células en lisados de Drosophila

Cell-free mRNA in vitro translation has played a crucial role in the understanding of the protein synthesis process during gene expression across ...

Nuestra investigación emplea un sistema de traducción acelular de drosófila para estudiar la síntesis de proteínas y la revelación traduccional en diversas etapas del desarrollo de insectos. Este protocolo recrea con precisión los eventos de traducción in vivo específicos del desarrollo de insectos, a diferencia de los lisados de metazoos distantes. Para comenzar, abra el software de clonación Benchling.Seleccione un plásmido adecuado para insertar el constructo que contenga una región no traducida en cinco prima, un cistrón reportero de luciferasa de luciérnaga o Fluc, una región no traducida en tres prima y una cola de poliadenilato o poli(A) ubicada aguas abajo de un promotor T7. Utilice el sitio de restricción único de KPN1 inmediatamente aguas abajo de la cola de poli(A) para linealizar cada constructo de plásmido antes de la transcripción. Verifique los picos limpios y bien resueltos de los constructos obtenidos mediante secuenciación antes de usarlos como plantillas para la transcripción in vitro.Separar el ADN linealizado mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % a 100 voltios durante una hora. Extraer el ADN linealizado del gel. Colocarlo en un microtubo y añadir ta

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Investigación

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El control de la síntesis de proteínas ocurre principalmente en la etapa de iniciación de la traducción, cuyas deficiencias están relacionadas con diversos trastornos. Para comprender mejor su etiología, describimos aquí un protocolo utilizando ovocitos de Xenopus laevis que evalúa la traducción de la transcripción mos en presencia de un mutante del factor de iniciación de la traducción eIF4G1.

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TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

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Preparación a mediano plazo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embriones para experimentos proteómicos

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