Evaluación del efecto de los filtros y prefiltros recubiertos sobre la infectividad y concentración del virus Phi6 aerosolizado

Investigamos el efecto de los prefiltros y los recubrimientos antivirales en la reducción de la infectividad y concentraciones de virus en el aire en entornos interiores. Los enfoques actuales no presentan dinámicas realistas del flujo de aire. Nuestro protocolo recrea las condiciones de aerosoles y mide tanto los virus infecciosos como la carga viral total.

Para empezar, diluir la suspensión purificada de bacteriófagos phi6 en un tampón de fosfato potásico de 20 milimolares que contenga un cloruro de magnesio milimolar ajustado a pH 7,2. Ensambla todos los materiales del filtro, prefiltro y recubrimiento antiviral dentro del armario de bioseguridad para realizar las pruebas superficiales. Evalúa la actividad antiviral de todos los materiales de recubrimiento basados en componentes activos de cobre o cobre y plata incrustados en matrices propietarias, concretamente A6, B4, VS y VS B en piezas planas de prueba.

A continuación, se pipetean 20 microlitros de solución de celulo bacteriano phi6 diluido sobre piezas de prueba recubiertas para realizar el ensayo de viabilidad superficial. Distribuye la muestra uniformemente sobre un área de dos por dos centímetros usando un triángulo de vidrio estéril. Incubar las muestras a 22 grados Celsius hasta cuatro puntos temporales, incluyendo un minuto, cinco minutos, una hora o tres horas.

Añade 180 microlitros de caldo fresco de LB a la superficie para recuperar los virus después de cada momento. Lava la superficie pipeteando repetidamente entre 10 y 20 veces para recoger la muestra. Usa una placa de Petri de plástico como superficie de control.

Cuantificar la eficacia antiviral de los recubrimientos superficiales mediante ensayo de placa para medir el número de partículas virales infecciosas y reacción en cadena de la polimerasa inversa cuantitativa, o qRT-PCR, para determinar el número de copias del genoma viral. Diluir la suspensión purificada y concentrada de bacteriófagos phi6 como se demostró anteriormente para obtener una concentración viral en el rango de 2,5 por 10 a la potencia de 10, a 4,08 por 10 por la potencia de 11 unidades formadoras de placa por mililitro. A continuación, monta la cámara experimental de aerosoles usando un cuerpo cilíndrico de vidrio con una tapa a juego.

Inserta el andamio metálico interno en la cámara y asegura juntas aislantes para asegurar un sellado hermético. Utiliza un nebulizador en combinación con una bomba de aire para generar una entrada estable y reproducible de aerosoles virales. Ajusta la solución viral utilizada en el nebulizador antes y después de cada experimento para monitorizar la estabilidad.

Ajusta el caudal de aerosol a ocho litros por minuto dentro de la cámara. Para reducir la humedad durante mediciones prolongadas, dirige aproximadamente tres cuartas partes del flujo de aerosol hacia los gases de escape a través de un filtro de aire particulado de alta eficiencia, o HEPA. Permite que el cuarto restante del flujo correspondiente a dos litros por minuto entre en la cámara.

Utiliza un embudo para dirigir el flujo de aerosol hacia el filtro o la superficie del prefiltro dentro de la cámara. Deshumidifica el flujo de aire saliente usando un desecador para proteger el filtro HEPA y el caudalímetro de la humedad excesiva. Utilizando la bomba externa, se crea presión negativa dentro del sistema y se apoya aún más el flujo de aire para asegurar un escape eficiente a través del puerto de salida.

Evalúa las propiedades antivirales de los prefiltros de poliéster y bulpren sin recubrimiento B o VS junto con materiales de fibra de vidrio de doble capa dentro de la cámara de aerosol. Para evaluar el efecto antiviral mediante muestreo por impactación, coloque una placa de Petri que contenga un tampón HEPES de 20 milimolares a pH 7,2 justo debajo del prefiltro de prueba para maximizar la deposición de partículas. Alternativamente, para probar el efecto antiviral de los filtros GF2, instala un impinger giratorio de triple boquilla totalmente de vidrio conectado a una bomba externa para la recogida de aerosoles.

Mantener el flujo de aire a través del prefiltro o filtro de prueba a dos litros por minuto. Aumenta la entrada total de aire a 10 litros por minuto usando una válvula adicional después de la salida de la cámara. Captura los aerosoles en cinco mililitros de buffer HEPES de 20 milimolares.

Y repone el buffer evaporado cada 30 minutos. Para el muestreo triplicado, realiza pruebas de control sin prefiltros ni filtros durante 15 minutos antes y después de cada experimento. Tras la prueba de control previa al experimento, inserta el filtro o prefiltro en la cámara y opera el sistema durante tres horas.

Recoge aerosoles virales recuperando un mililitro de suspensión de placas de Petri que contienen 20 mililitros de tampón cada 30 minutos. Quita el filtro y realiza una prueba de control posterior al experimento. Recoger muestras cada 30 minutos durante el experimento para obtener ocho muestras qRT-PCR y de titulación cada una por experimento.

En los experimentos con impactor, se recogen muestras de titulación solo una vez al final de las tres horas de expedición. Utilizar 800 microlitros de la muestra recogida para el análisis qRT-PCR y los 200 microlitros restantes para la titulación del virus. Congela rápidamente las muestras de qRT-PCR en nitrógeno líquido y alárdalas a 80 grados Celsius.

Procesa inmediatamente las muestras de titulación del virus usando el ensayo de placa. Los ensayos de viabilidad superficial demostraron que todos los recubrimientos probados inactivaron con éxito el virus, observándose reducciones significativas en los primeros cinco minutos. El recubrimiento superficial a base de cobre, B4, logró la reducción más rápida, disminuyendo el recuento de infecciosos en tres órdenes de magnitud en cinco minutos, y alcanzando la inactivación completa con un límite de detección inferior a 100 unidades formadoras de placa por mililitro en 15 minutos.

El recubrimiento A6 logró la inactivación total del virus en 25 minutos, y el VS B en 60 minutos. El recubrimiento VS mostró la tasa de inactivación más lenta entre los materiales probados. Los prefiltros estudiados BP6, S11 y FMR5 fueron igualmente efectivos para reducir el número de virus infecciosos, atravesándolos entre 1,5 y 2 órdenes de magnitud en comparación con el control sin filtro.

Los filtros GF2 demostraron un rendimiento superior, reduciendo la carga viral en al menos seis órdenes de magnitud, y no se detectaron placas infecciosas del virus phi6 dentro del límite de detección. El recubrimiento VS B no afectó significativamente la eficacia de la filtración del virus infeccioso en comparación con los prefiltros sin recubrimiento. Los resultados de qRT-PCR mostraron que los prefiltros redujeron el número de copias del genoma viral hasta en dos órdenes de magnitud.

El filtro GF2 mostró una disminución de hasta cuatro órdenes de magnitud en comparación con el control sin filtro. Aunque las diferencias entre los prefiltros y el control permanecieron insignificantes durante los primeros 30 minutos, la eficiencia de filtrado mecánico aumentó respecto al punto de tiempo de 60 minutos. Además, la aplicación del recubrimiento VS B no tuvo efecto medible sobre el número de genomas virales que pasan por el medio filtrante.

Este protocolo permite a los investigadores cuantificar la inactivación viral, la eficiencia de filtración y las diferencias entre partículas infecciosas y la carga viral total. Un desafío clave es el tiempo muy corto de contacto con la superficie del virus durante el flujo de aire, lo que limita la eficacia de los recubrimientos antivirales. Estudios futuros pueden explorar la combinación de recubrimientos con UV o pruebas en sistemas de ventilación reales y con diversos virus.