Name: Marcado fluorescente endógeno mediado por CRISPR/Cas9 de genes específicos de la línea germinal en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprende a etiquetar proteínas endógenas con CRISPR/Cas9 en la línea germinal de Caenorhabditis elegans. Este protocolo permite generar alelos knock-in estables para analizar la localización proteica in vivo con control nativo.

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	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+a+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 1-16 (2013).</li><li>Ebbing, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+transcriptomics+of+C.+elegans+males+and+hermaphrodites+identifies+sex-specific+differences+in+gene+expression+patterns.">Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns.</a> Dev Cell. 47 (6), 801-813.e6 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+single-cell+architecture+of+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans+germ+cells.">Spatiotemporal single-cell architecture of gene expression in Caenorhabditis elegans germ cells.</a> Cell Discov. 11 (1), 26 (2025).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Fire, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+silencing+and+the+maintenance+of+a+functional+germline+in+Caenorhabditis+elegans.">Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 125 (13), 2451-2456 (1998).</li><li>Robert, V. J., Sijen, T., van Wolfswinkel, J., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+RNAi+factors+protect+the+C.+elegans+germline+against+repetitive+sequences.">Chromatin and RNAi factors protect the C. elegans germline against repetitive sequences.</a> Genes Dev. 19 (7), 782-787 (2005).</li><li>Merritt, C., Seydoux, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+solutions+for+the+germline.">Transgenic solutions for the germline.</a> WormBook. , 1-21 (2010).</li><li>Fr&#x00F8;kj&#x00E6;r-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans.">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li><li>Vallin, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+collection+of+Mos1+transposon+insertion+mutants+for+the+C.+elegans+research+community.">A genome-wide collection of Mos1 transposon insertion mutants for the C. elegans research community.</a> PLoS One. 7 (2), e30482 (2012).</li><li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination.">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Nance, J., Fr&#x00F8;kj&#x00E6;r-Jensen, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+transgenic+toolbox.">The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox.</a> Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+to+study+spermatogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Protocol for CRISPR-Cas9-mediated genome editing to study spermatogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102720 (2023).</li><li>Khan, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+ligation-independent+cloning+system+for+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+in+plants.">A highly efficient ligation-independent cloning system for CRISPR/Cas9-based genome editing in plants.</a> Plant Methods. 13, 86 (2017).</li><li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748 (2021).</li><li>Rieckher, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+microinjection.">Caenorhabditis elegans microinjection.</a> Bio Protoc. 7 (19), e2584 (2017).</li><li>Medley, J. C., Hebbar, S., Sydzyik, J. T., Zinovyeva, A. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+substitutions+effectively+block+Cas9+and+allow+for+scarless+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Single nucleotide substitutions effectively block Cas9 and allow for scarless genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 220 (1), iyab199 (2022).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833 (2008).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Sci Rep. 6, 20889 (2016).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NATF+(native+and+tissue-specific+fluorescence):+a+strategy+for+bright,+tissue-specific+GFP+labeling+of+native+proteins+in+Caenorhabditis+elegans.">NATF (native and tissue-specific fluorescence): a strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).</li><li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans.">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. 121-122, 86-93 (2017).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Beijing Lablead Biotech Co., Ltd.</td><td>QZ02</td><td>Componente para preparar placas de agar NGM</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>NOVON</td><td>ZZ14011</td><td>Preparar almohadillas de agarose al 2%</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans strain N2&nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Cepa de fondo para inyección</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td>Aclarar la mezcla de inyección</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Beijing Chemical Reagents Company</td><td>57-88-5</td><td>Componente para preparar placas de agar NGM</td></tr><tr><td>Plásmido marcador de co-inyección rol-6 (su1006) (pRF4)</td><td>Guangshuo Ou Lab</td><td></td><td>Marcador rodador para enriquecer candidatos</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>ZEISS</td><td>LSM880 + Airyscan</td><td>Validar la expresión/localización de GFP</td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato dipotásico (K2HPO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7758-11-4</td><td>Componente para preparar placas de agar NGM</td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato di-sódico (Na2HPO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7558-79-4</td><td>Componente para preparar el tampón M9</td></tr><tr><td>Escalera de ADN</td><td>Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.</td><td>MF288-01</td><td>Referencia de tamaño para geles de agarose</td></tr><tr><td>Estructura base del plásmido donante (pPD95.75)</td><td>Addgene</td><td>1494</td><td>Estructura base para la construcción del donante HDR</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis&nbsp;</td><td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>112-0630</td><td>Separar los productos de PCR en geles de agarose para la detección de uniones y el genotipado de la cigosidad</td></tr><tr><td>Escherichia coli cepa OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Fuente de alimento para gusanos</td></tr><tr><td>Plásmido marcador de co-inyección fluorescente (pPD122.11)</td><td>Fire Lab</td><td></td><td>Co-marcador GFP para enriquecer candidatos</td></tr><tr><td>Estereomicroscopio fluorescente</td><td>SOPTOP</td><td>SZX12-HT</td><td>Examinar gusanos vivos para detectar marcadores de co-inyección fluorescentes</td></tr><tr><td>GelRed Stain de ácidos nucleicos para gel</td><td>Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.</td><td>MF079-plus-01</td><td>Visualización de bandas de ADN</td></tr><tr><td>Cápsulas de vidrio</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Usado con el extractor de agujas para hacer agujas de inyección</td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td>Prevenir la desecación durante la inyección</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Wuhan Ruihua Instrument &amp; Equipment Co., Ltd.</td><td>HP400S</td><td>Mantener los gusanos a temperatura estándar</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (MgSO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7487-88-9</td><td>Componente para preparar placas de agar NGM y el tampón M9</td></tr><tr><td>Pipetas microcapilares</td><td>KIMBLE</td><td>71900-50</td><td>Calentadas y rotas para crear herramienta de carga</td></tr><tr><td>Unidad de microinyección</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet 4i</td><td>Suministra pulsos de presión controlada de la mezcla de inyección al gónada distal mediante una aguja de microinyección (activada por pedal)</td></tr><tr><td>Portaobjetos para microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12545A 22&times;30-1</td><td>Preparar almohadillas de agarose al 2% para montar e inmovilizar gusanos durante la microinyección; Abre las puntas de las agujas de inyección contra el borde del cubreobjetos</td></tr><tr><td>Microscopio para microinyección</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer.A1</td><td>Microscopio de inyección</td></tr><tr><td>Extractor de agujas</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Modelo P97</td><td>Hacer que las cápsulas de vidrio se transformen en agujas de inyección</td></tr><tr><td>Termociclador PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Amplificación PCR</td></tr><tr><td>pDD162 (Peft-3::Cas9 + sgRNA vacío)</td><td>Addgene</td><td>47549</td><td>Expresión de Cas9 + sgRNA</td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Gibco</td><td>308723</td><td>Componente para preparar placas de agar NGM</td></tr><tr><td>Fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4)&nbsp;</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7778-77-0</td><td>Componente para preparar placas de agar NGM y el tampón M9</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7647-14-5</td><td>Componente para preparar placas de agar NGM y el tampón M9</td></tr><tr><td>Estereomicroscopio</td><td>Motic</td><td>K400L</td><td>Coger y montar gusanos en almohadillas de agarose y realizar pasos de recuperación post-inyección</td></tr></tbody></table>

marcado fluorescente endógeno mediado por crispr/cas9 de genes específicos de la línea germinal en caenorhabditis elegans

CRISPR/Cas9-mediated Endogenous Fluorescent Tagging of Germline-specific Genes in Caenorhabditis elegans

Marcado fluorescente endógeno mediado por CRISPR/Cas9 de genes específicos de la línea germinal en Caenorhabditis elegans

Protein localization in the Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is central to interpreting gene function during gametogenesis, yet conventional ...

crisprcas9-mediated-endogenous-fluorescent-tagging-germline-specific

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Investigación

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Biology

Biología

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

Este video describe la microinyección, un método común para crear cepas transgénicas de C. elegans. En el ejemplo, veremos el uso de la microinyección para introducir un complejo de ribonucleoproteína (RNP) para la edición de genes con bases CRISPR.

Microinyección de gónadas: un método de administración de compuestos directamente en la línea germinal de C. elegans

Aquí, presentamos un método para diseñar el genoma de C. elegans utilizando ribonucleoproteínas Cas9 CRISPR y plantillas de reparación dependiente de homología.

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

Este protocolo muestra cómo realizar el seguimiento un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor usando una fluorescencia verde (GFP) fusion proteína como marcador y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción. El protocolo de tinción de DAPI es rápido y conserva las señales de localización subcelular de GFP y proteína.

Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans

Se describe aquí es un protocolo para etiquetar endógeno expresado proteínas con las etiquetas fluorescentes en las células de vástago humanas pluripotentes inducidas mediante CRISPR/Cas9. Células supuestamente editadas se enriquecen con clasificación de celda de fluorescencia activada y se generan líneas de células clonales.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

El objetivo de este protocolo es permitir la edición CRISPR/Cas9 sin fisuras del genoma de C. elegans utilizando complejos de ribonucleoproteína ensamblados y el marcador co-CRISPR dpy-10 para el cribado. Este protocolo se puede utilizar para realizar una variedad de modificaciones genéticas en C. elegans, incluidas inserciones, deleciones, reemplazos de genes y sustituciones de codones.

CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

Aquí, presentamos un protocolo simplificado de etiquetado de genes endógenos para Drosophila, que utiliza una técnica basada en PCR para la identificación sin marcadores de modificaciones genéticas exitosas, lo que facilita el desarrollo de líneas knock-in estables.

Estrategia basada en CRISPR de un solo paso para el etiquetado de genes endógenos en Drosophila melanogaster

Este protocolo describe un ensayo de interferencia de ARN y ChIP para estudiar la herencia epigenética del silenciamiento inducido por ARNi y las modificaciones asociadas a la cromatina en C. elegans.

Análisis de la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

El artículo describe la optimización de los parámetros de adquisición de microscopía de fluorescencia para visualizar el transporte axonal de cargas endógenas marcadas con una resolución de una sola neurona en un nematodo vivo.

Optimización de la visualización del transporte axonal de carga endógena mediante microscopía de fluorescencia en Caenorhabditis elegans vivos

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

Aquí, presentamos un protocolo para marcar proteínas con una etiqueta de proteína de fluorescencia en larvas de pez cebra, un sistema in vivo recientemente desarrollado y modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baja abundancia en pez cebra.

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Aprende a etiquetar proteínas endógenas con CRISPR/Cas9 en la línea germinal de Caenorhabditis elegans. Este protocolo permite generar alelos knock-in estables para analizar la localización proteica in vivo con control nativo.

Marcado fluorescente endógeno mediado por CRISPR/Cas9 de genes específicos de la línea germinal en Caenorhabditis elegans

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