Marcado fluorescente endógeno mediado por CRISPR/Cas9 de genes específicos de la línea germinal en Caenorhabditis elegans

Utilizamos el marcado endógeno basado en CRISPR para estudiar la localización y dinámica de las proteínas germinales en C. elegans. Los transgenes convencionales pueden afectar la expresión germinal, pero este protocolo marca proteínas en el locus endógeno bajo control nativo. Para empezar, identifica los genes candidatos con expresión predominante en la gónada o células germinales utilizando bases de datos públicas y literatura publicada.

Tras abrir la entrada UniProt para la proteína objetivo, haz clic en Estructura para evaluar características estructurales y dominios proteicos e identificar un sitio adecuado de marcado fluorescente. Desplázate hacia abajo y abre la entrada de la base de datos AlphaFold para verificar los valores de confianza del modelo. Haz clic en Dominios para clasificaciones estructurales específicas.

A continuación, abre la página del gen objetivo en WormBase. Desplázate hacia abajo y haz clic en el widget de Secuencias, y en el enlace principal de la transcripción para abrir la página de transcripción. Desplázate hacia abajo hasta la sección de Secuencias y haz clic en la opción específica para revelar la secuencia empalmada de la transcripción seleccionada.

En la página web de la Herramienta de Diseño de ARN de la Guía IDT CRISPA-Cas9, copia y pega la primera secuencia de exones del gen objetivo desde la página de WormBase, y selecciona C, elegans en el menú desplegable de Especies para el diseño de ARN o gRNA guía. Haz clic en el botón DESIGN para obtener y revisar la secuencia de gRNA recomendada más recomendada y su correspondiente secuencia PAM. En SnapGene, selecciona Secuencia para identificar el punto de clonación entre el promotor de CeU6 y las regiones del andamiaje de gRNA.

Copia la secuencia de gRNA desde la página de la herramienta IDT, pégala en el cuadro de diálogo de inserción y haz clic en Insertar para integrar el espaciador en el plásmido de expresión CRISPR. Para confirmar la precisión de la inserción del gRNA, seleccione la secuencia y haga clic en Mostrar alineamientos para comparar el resultado de la secuenciación Sanger base por base con la secuencia esperada. Para construir el plásmido donante, copia las secuencias genómicas del brazo de homología de WormBase.

En SnapGene, pega la secuencia y haz clic en Insertar. A continuación, haz clic derecho en el sitio de inserción para abrir la ventana Establecer color de ADN y cámbiala a Naranja para marcar la unión. Copia la secuencia de inserción de proteína fluorescente verde o GFP y pégala directamente en la posición marcada.

Luego haz clic en Añadir función. Nombra la función GFP. Cambia el color de la pantalla a verde y haz clic en OK para completar el conjunto de plásmidos donantes in silico.

Para introducir una sustitución silenciosa en la plantilla del plásmido donante que evite el recorte de Cas9 tras la integración, se copia el espaciador de gRNA de 19 nucleótidos del vector de expresión. En la pestaña de plásmidos donantes, pega la secuencia en la barra de búsqueda de secuencia de ADN para localizar el sitio objetivo y selecciona la posición específica del nucleótido que mutará. En Reemplazar base, introduzca nuevo nucleótido y haga clic en Insertar.

Haz clic derecho en la base modificada y usa Establecer color de ADN para cambiar su color a rojo. Alinear los resultados de secuenciación de Sanger del plásmido donante con la secuencia esperada para confirmar la integridad. Prepara la mezcla de inyección combinando el plásmido de expresión CRISPR, el plásmido donante y los marcadores de coinyección en agua estéril doble destilada hasta un volumen final de 10 microlitros a la concentración indicada.

Luego centrifuga la mezcla a 10.000 g durante 10 a 20 minutos para eliminar partículas y evitar obstrucciones del capilar de microinyección. Utiliza un extractor de agujas para crear agujas de microinyección a partir de capilares de vidrio con un cico largo y punta afilada, adecuadas para la inyección de gonadales, optimizando empíricamente los ajustes polares. Calienta una micropipeta y rompe la capa en dos para crear una herramienta de carga.

Coloca una bombilla aspiradora de goma en el extremo ancho de la micropipeta microcapilar acortada. Aspira aproximadamente un microlitro de mezcla de inyección en el cargador. Introduce el cargador en la parte trasera de la aguja de inyección y dispensa suavemente la mezcla de inyección.

Coloca la aguja cargada horizontalmente durante 10 minutos para formar una columna continua y permitir que la solución se asiente hacia la punta. Monta la aguja en el microscopio de inyección y enfoca la punta usando ópticas de campo claro. Abre la punta de la aguja con un contacto suave con el borde de una capa de tapa en aceite de halocarbono y verifica el flujo.

Para cultivar los gusanos para inyección, mantener los gusanos silvestres N2 sobre placas de medio con semillas bacterianas OP50. Selecciona hermafroditas en la fase L4 de una placa sana e incuba a 20 grados Celsius durante 10 horas para obtener adultos jóvenes con líneas germinales bien desarrolladas. Transfiere los gusanos a una placa sin sembrar para reducir la transmisión bacteriana.

Prepara una compresa seca al 2% de agarosa sobre una lámina de cristal. Y aplica una gota de aceite de halocarbono. Usa un recogedor de pestañas para transferir un gusano a la almohadilla de agarosa e inmovilizarla.

Utiliza un objetivo de baja ampliación para orientar la gónada y la inyección. Utiliza controles de micromanipuladores para colocar la aguja en un ángulo de 20 a 40 grados respecto al gusano. Utiliza una gran ampliación para enfocar la línea germinal distal.

Avanza el gusano sobre la aguja y coloca la punta dentro del sincicio gonadal. Inyecta la solución hasta que la gónada se hinche. Retira la aguja y vuelve a colocarla para las inyecciones posteriores.

Añade buffer M9 para ablandar y descomponer parcialmente la almohadilla de agarosa para liberar gusanos. Transfiere cada gusano a una placa de recuperación individual. Luego repetir las inyecciones para 20 a 25 gusanos.

Examinar la progenie F1 para detectar marcadores de coinyección y seleccionar animales positivos para marcadores. Transfiere cada gusano F1 a una placa individual y deja de uno a dos días para la puesta de huevos. Lisa cada gusano F1 en un tampón de proteinasa K para preparar plantillas de PCR.

Realiza PCR de unión usando un cebador genómico fuera del brazo de homología y un cebador interno de etiquetas. Y conservar las placas correspondientes de animales F1 positivos para PCR. Aislar la descendencia de F2 de líneas F1 PCR-positivas en placas individuales para producir descendencia.

Lyse adultos para genotipado. Realizar PCR utilizando cebadores flanqueando los brazos de homología para distinguir alelos tipo salvaje y knock-in por tamaño del producto. Utiliza la herramienta SnapGene para verificar y validar la integración correcta tanto en las uniones de inserción izquierda como derecha alineando los resultados de la secuenciación de Sanger con la secuencia genómica editada esperada.

Utiliza microscopía de fluorescencia para verificar la expresión y localización de la línea germinal. Expande las líneas homocigotas confirmadas. Mantener existencias y líneas validadas en criopreservación para almacenamiento a largo plazo.

El cribado basado en PCR de descendientes de F1 reveló knock-ins exitosos identificados mediante amplicón de PCR de unión de 1.550 pares de bases utilizando un cebador genómico flanqueante y uno interno de GFP. La ausencia de la banda de 1.550 pares de bases en la mayoría de los animales F1 indicó que no había una integración detectable del objetivo, lo cual es compatible con una transmisión no integrativa de ADN más que con una reparación dirigida por homología. La determinación de cigosidad en descendientes de F2 derivados de líneas PCR-positivas en unión distingue alelos por el tamaño de la banda en 1.345 pares de bases como alelo de tipo salvaje, y 2.344 pares de bases como alelo knock-in.

Los heterocigotos muestran ambas bandas. Las muestras homocigotas knock-in carecen de la banda de tamaño tipo salvaje, y las muestras con integración fallida solo muestran el producto de tamaño tipo salvaje. Se realizó una validación adicional de la línea homocigota de GFP mediante imagen microscópica confocal, donde se observó fluorescencia de GFP en las células germinales con señal enriquecida en la región espermatogénica.

Este protocolo permite el análisis in vivo de la localización y dinámica de proteínas en la línea germinal de C. elegans. Un diseño cuidadoso de las etiquetas y una validación exhaustiva son esenciales para preservar la función proteica y minimizar los candidatos a falsos positivos. Estudios futuros pueden utilizar este flujo de trabajo para rastrear la localización de proteínas y explorar posibles interacciones durante el desarrollo de la línea germinal.