Identificación de histonas modificadas como sustratos de unión del miembro 4 de la familia de la espiglina humana (SPIN4) mediante matrices peptídicas y pulldown nativo de nucleosomas

SPIN4 es un lector de histonas que regula el desarrollo óseo. Las mutaciones en SPIN4 causan un crecimiento excesivo, pero su papel patógeno sigue sin estar claro. Este protocolo puede adaptarse y aplicarse para estudiar sustratos de unión de proteínas que se unen a histonas en todos los espacios.

Para empezar, prepara el tampón bloqueante pesando cinco gramos de albúmina sérica bovina, o BSA, y disolviéndola en 100 mililitros de tampón de almacenamiento proteico de BC-150. A continuación, utiliza un bolígrafo hidrofóbico para delimitar el área de reacción en la matriz de péptidos y así conservar los reactivos. Luego coloca papeles de filtro en una placa de Petri de 15 centímetros y humédelos con agua.

Coloca los arreglos sobre papeles de filtro humedecidos y añade cuidadosamente 300 microlitros de tampón bloqueante a cada área del array. Cubre e incuba la placa de Petri a temperatura ambiente durante una a tres horas. Preparar un micromolar de Spindlin-4 marcado con FLAG recombinante, o proteína SPIN4 FLAG, y 1X control peptídico FLAG, cada uno en un tampón bloqueador.

Transfiere los reactivos y la antena de la matriz a una cámara fría para reducir el fondo de fondo y mejorar la relación señal-ruido. Elimina el exceso de búfer de bloqueo de los arrays. Añade la proteína FLAG SPIN4, o control péptido FLAG, en cada bloque.

Cubre la placa de Petri para incubarla durante la noche en la cámara fría. Añade 50 mililitros de buffer de lavado de matriz peptídica a una caja de lavado. Descarta la solución proteica de los arreglos y transfierela al buffer de lavado con el lado de reacción hacia arriba.

Lava los arreglos cinco veces. Realiza los dos primeros lavados durante un minuto cada uno, seguidos de tres lavados posteriores de cinco minutos cada uno. Luego enjuaga con buffer bloqueante para eliminar los detergentes residuales.

Coloca las matrices de nuevo en la placa de Petri. Añade 300 microlitros de anticuerpo anti-FLAG a cada bloque e incuba durante una hora a temperatura ambiente. Descarta la solución de anticuerpos, transfiere los arreglos al buffer de lavado y repite los lavados como se ha demostrado anteriormente.

Añadir 300 microlitros de solución secundaria de anticuerpos anti-ratón de ratón conjugada con HRP a cada bloque e incubar durante una hora a temperatura ambiente. Descarta la solución de anticuerpos y lava el array cinco veces, como se ha demostrado anteriormente. Coloca las matrices dentro de un protector transparente y añade un mililitro de sustrato de quimioluminiscencia mejorada, o ECL, asegurando una cobertura uniforme.

Elimina las burbujas de aire atrapadas. Captura quimioluminiscentes en imágenes de campo brillante usando un generador de imágenes digitales. Después de subir el archivo de datos en bruto al software MODified Histone Peptide Array Analysis, en la pestaña Alineación Puntual, confirma que cada cuadrícula está centrada en su punto peptídico.

En Estadísticas Puntuales, comprueba la correlación puntual duplicada y asegúrate de que el error sea inferior al 5%. Utiliza la pestaña Reactividad para evaluar la unión entre diversas modificaciones de histonas. Luego utiliza la pestaña de Especificidad para determinar la preferencia relativa de unión del péptido objetivo entre diferentes modificaciones de histonas. Para preparar 2X tampón bloqueador de perlas, añade un gramo de BSA a 10 mililitros de tampón de lisis BC-150 y vórtice para disolver.

Transfiere las perlas mutantes FLAG SPIN4 tipo salvaje y las perlas mutantes FLAG SPIN4 D82H que contienen concentraciones equimolares en tubos separados de 1,5 mililitros. A la muestra tipo salvaje, añade un volumen igual de 100 perlas de control negativo de péptido 1X FLAG. Ajusta todas las muestras a volúmenes uniformes usando una cantidad adecuada de tampón de lisis BC-150.

Añade un volumen igual de buffer bloqueador de perlas 2X a cada tubo para completar el volumen final de un mililitro. Incuba durante la noche en un rotador de tubo ajustado a cuatro grados Celsius y 20 RPM. Para iniciar la unión de nucleosomas, descongela 1X mononucleosomas extraídos de HEK293FT células sobre hielo.

Para una optimización inicial, calcular una proporción molar de uno en uno de 1X nucleosoma respecto a proteína SPIN4. Mezcla 1X nucleosoma con un volumen igual de 2X buffer bloqueador de perlas. Luego combina la mezcla con perlas prebloqueadas en un tubo de 15 mililitros e incuba durante cuatro horas en un rotador de tubo a cuatro grados Celsius y 20 RPM para la complejidad.

Centrifuga la mezcla a 3000 G durante tres minutos a cuatro grados Celsius. Tras descartar el sobrenadante, resuspende las perlas en un mililitro de tampón lisis de BC-150 y transfiere a tubos de 1,5 mililitros. Para lavar las perlas tres veces, centrifuga a 3000G durante un minuto.

Tras descartar el sobrenadante, resuspende el pellet en un mililitro de buffer de lisis de BC-150. Agita el tubo ocasionalmente para una distribución uniforme de las cuentas entre lavados repetidos. Luego realiza dos lavados adicionales, incorporando un paso de incubación de 10 minutos en un rotador a 20 RPM y cuatro grados Celsius entre los pasos de resuspensión y centrifugación.

Tras el lavado final, resuspende las perlas en volúmenes de nueve columnas de tampón de lisis BC-150. Mezcla 160 microlitros de perlas de cada muestra con 40 microlitros de tampón de Laemmli 5X. Calienta a 95 grados Celsius durante cinco minutos para desnaturalizar.

Opcionalmente, para obtener resultados más limpios con menor fondo de fondo, realizar una ilusión peptídica FLAG del complejo nucleosomico proteico. Centrifuga a 3000G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego realiza tinción de plata y Western blot para validar y detectar la unión modificada de histonas SPIN4.

SPIN4 se une significativamente a la histona H3 Lisina 4, o H3K4, monometil, dimetilo y trimetilo péptidos. Por el contrario, el mutante de pérdida de función SPIN4 D82H mostró una reducción de la unión a todos los objetivos, confirmando que el dominio Tudor 1 es esencial para la unión al sustrato. La afinidad de unión de SPIN4 se ve afectada negativamente por otras modificaciones postraduccionales que insisten en confirmaciones, como H3R2me2s y H3R2me2a.

Observaciones consistentes en matriz de péptidos, SPIN4 D82H mostró una reducción global de la unión a nucleosomas en relación con SPIN4 de tipo salvaje. El análisis de Western blot comparando las muestras de pulldown de SPIN4 y SPIN4 D82H mostró además que no se puede unir cuantificablemente el SPIN4 D82H a péptidos monometil, dimetilo o trimetil H3K4, validando estos enfoques duales para identificar rápidamente sustratos relativos de modificación posttraduccional de histonas. Validación rápida y dirigida de los sustratos de unión de proteínas de unión a histonas.

Las condiciones requeridas para la expresión y purificación de las proteínas de unión a histonas de cada candidato pueden variar. La espectrometría de masas histonas, tras el pulldown nativo de mononucleosomas, proporcionará el alcance completo de las PTM de histonas.