Name: Identificación de histonas modificadas como sustratos de unión del miembro 4 de la familia de la espiglina humana (SPIN4) mediante matrices peptídicas y pulldown nativo de nucleosomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a identificar sustratos de unión de SPIN4 mediante matrices peptídicas y pulldown de nucleosomas nativos. Este protocolo permite caracterizar lectores de histonas implicados en regulación del crecimiento óseo.

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<ol><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+variant+in+SPIN4+causes+an+X-linked+overgrowth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome.</a> JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).</li>
<li>Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+observation+of+a+rare+Binder+phenotype+with+fetal+overgrowth+due+to+a+SPIN4+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Matern+Fetal+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation.</a> Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).</li>
<li>Lu, R., Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tudor%3A+a+versatile+family+of+histone+methylation+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Tudor: a versatile family of histone methylation readers.</a> Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).</li>
<li>Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+engagement+of+chromatin+modifications+by+linked+binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).</li>
<li>Mauser, R., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+modified+histone+peptide+arrays+in+chromatin+research%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Application of modified histone peptide arrays in chromatin research.</a> Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).</li>
<li>Hsu, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraspeckle+protein+NONO+regulates+active+chromatin+by+allosterically+stimulating+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1.</a> Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).</li>
<li>Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+reconstituting+enzymatic+activities+for+ultra-large+histone+methyltransferases+NSD1+and+SETD2+using+a+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).</li>
<li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+shotgun+quantitative+mass+spectrometry+characterization+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones.</a> J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).</li>
<li>Fuhrmann, J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+and+citrullination+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation.</a> ACS Chem Biol. 11, 654(2015).</li>
<li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+histone+H3+%E2%80%9CK4me3-K9me3%2F2%E2%80%9D+methylation+pattern+readout+by+Spindlin1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1.</a> J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).</li>
<li>Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+H3K9-methylated+heterochromatin+and+its+functions+in+tissue+differentiation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).</li>
<li>Greschik, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+code+reader+Spin1+controls+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development.</a> Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos microcentrífugas de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td>Experimentos generales</td></tr><tr><td>Plato de cultivo tisular de 15 cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903.300</td><td>Experimentos generales</td></tr><tr><td>Tubos centrífugos cónicos de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.101</td><td>Experimentos generales</td></tr><tr><td>Tubos centrífugos cónicos de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.548.004</td><td>Experimentos generales</td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer de 500 mL</td><td>Stellar Scientific</td><td>CT229809</td><td>Cultivo celular Sf9</td></tr><tr><td>Amersham ImageQuant 800 CCD Imager</td><td>Cytiva</td><td>IMQ800</td><td>Sistema de imagen CCD</td></tr><tr><td>Gel de afinidad anti-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>Pulldown bioquímico</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0017</td><td>Inhibidor de proteasa</td></tr><tr><td>Array Analyze Sofrware</td><td>Motivo activo</td><td>https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip</td><td>Análisis de datos de matriz de péptidos MODificados</td></tr><tr><td>ASI Agarose LE</td><td>Alkali Scientific</td><td>A7700</td><td>Gel de ADN</td></tr><tr><td>Sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac</td><td>Termo Científica</td><td>10359016</td><td>Expresión baculoviral</td></tr><tr><td>Clorhidrato de benzamidina</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-W018781</td><td>Inhibidor de proteasa</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Estándar de cuantificación de proteínas</td></tr><tr><td>Bromofenol Azul</td><td>Termo Científica</td><td>A18469.08</td><td>Amortiguador de Lammeli</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Termo Científica</td><td>20278</td><td>Tinción en gel Protien</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (TDT)</td><td>Sigma-Aldrich & nbsp;</td><td>D5545</td><td>Búfer de lisis</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Productos de investigación RPI</td><td>E58100</td><td>Búfer de lisis</td></tr><tr><td>Sustrato de Quimioluminiscencia Mejorada (ECL)</td><td>Cytiva</td><td>RPN2232</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Medio de cultivo celular de insectos ESF 921</td><td>Sistemas de expresión</td><td>96-001</td><td>Cultivo celular Sf9</td></tr><tr><td>Etanol (200 grados)</td><td>Química del espectro</td><td>ET107</td><td>Precipitación del ADN</td></tr><tr><td>Sistema de imagen EVOS M5000</td><td>Invitrogen</td><td>M5000</td><td>Imagen general</td></tr><tr><td>Péptido FLAG</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7006</td><td>Elución de pulldown</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich & nbsp;</td><td>G77893</td><td>Búfer de almacenamiento</td></tr><tr><td>Anticuerpo H3K4me1 y nbsp;</td><td>Motivo activo</td><td>39300</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticuerpo H3K4me2 y nbsp;</td><td>Señalización celular</td><td>9725T</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticuerpo H3K4me3&nbsp;</td><td>Señalización celular</td><td>9751T</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>HEK293FT celdas</td><td>Termo Científica</td><td>R70007</td><td>Línea de fibroblasts renales embrionarios humanos</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich & nbsp;</td><td>H3375</td><td>Búfer de lisis</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td>&nbsp; Programa de procesamiento de imágenes basado en Java</td></tr><tr><td>Hemisulfato de leupeptina</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-18234A</td><td>Inhibidor de proteasa</td></tr><tr><td>Nucleasa microcócica (MNasa)</td><td>NEB&nbsp;</td><td>M0247S</td><td>Endonucleasa para la digestión de la cromatina</td></tr><tr><td>Modelo 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>Sonicación</td></tr><tr><td>Matriz de Péptidos de Histonas MODIFICADAS</td><td>Motivo activo</td><td>13005</td><td>Ensayo de unión a proteínas</td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0018</td><td>Inhibidor de proteasa</td></tr><tr><td>Fracción de IgG de peroxidasa IgG anti-ratón monoclonal de cabra, específica de cadena ligera</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-174</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>pFastBac1-Flag-SPIN4</td><td>Termo Científica</td><td>10360014</td><td>Vector de expresión baculoviral</td></tr><tr><td>pFastBac1-Flag-SPIN4-D82H</td><td>Termo Científica</td><td>10360014</td><td>Vector de expresión baculoviral</td></tr><tr><td>Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Purificación del ADN</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce Rapid Gold BCA</td><td>Termo Científica</td><td>PIA53226</td><td>Cuanticaitón de proteínas</td></tr><tr><td>Kit de tinte de plata Pierce</td><td>Termo Científica</td><td>24612</td><td>Detección de proteínas</td></tr><tr><td>Inhibidor de la Proteasa PMSF</td><td>Termo Científica</td><td>36978</td><td>Inhibidor de proteasa</td></tr><tr><td>Gel de poliacrilamida</td><td>Fabricado internamente</td><td>N/A</td><td>Gel proteico</td></tr><tr><td>Células de insectos Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td>Línea celular de insectos para la expresión de baculovirus</td></tr><tr><td>Dispositivo de diálisis Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO</td><td>Termo Científica</td><td>69572</td><td>Diálisis de proteínas</td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>Precipitación del ADN</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio y nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP358-1</td><td>Amortiguadores generales</td></tr><tr><td>Dodecilo sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich & nbsp;</td><td>L3771</td><td>Amortiguadores generales</td></tr><tr><td>Solución azul de tripán (0,4%)</td><td>Termo Científica</td><td>15250061</td><td>Tinción de núcleos</td></tr></tbody></table>

identificación de histonas modificadas como sustratos de unión del miembro 4 de la familia de la espiglina humana (spin4) mediante matrices peptídicas y pulldown nativo de nucleosomas

Identification of Modified Histones as Binding Substrates of Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) by Peptide Arrays and Native Nucleosome Pulldown

Identificación de histonas modificadas como sustratos de unión del miembro 4 de la familia de la espiglina humana (SPIN4) mediante matrices peptídicas y pulldown nativo de nucleosomas

Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) has just emerged as a novel regulator of bone growth. Loss-of-function variants in SPIN4 were identified in ...

identification-modified-histones-as-binding-substrates-human-spindlin

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Los avances en la espectrometría de masas han permitido el análisis de alto rendimiento de la expresión de proteínas y la modificación en un huésped de tejidos. En combinación con el fraccionamiento subcelular y modelos de enfermedad, espectrometría de masa cuantitativa y bioinformática puede revelar nuevas propiedades en los sistemas biológicos. El método descrito en la presente memoria analiza asociadas a la cromatina proteínas en el contexto de las enfermedades del corazón y es fácilmente...

Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

En este protocolo, describimos una novedosa técnica BrdU-ChIP-Slot-Western para examinar proteínas y modificaciones de histonas asociadas con ADN recién sintetizado o naciente.

El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica

Este protocolo describe un flujo de trabajo totalmente integrado para la caracterización de las histonas modificaciones post-traduccionales utilizando espectrometría de masas (MS). El flujo de trabajo incluye la purificación de la histona de cultivos de células o tejidos, la derivación de histonas y la digestión, el análisis de MS utilizando cromatografía líquida de flujo nano e instrucciones para el análisis de datos. El protocolo está diseñado para dentro de 2 - 3 días.

Flujo de trabajo completo para el análisis de las histonas modificaciones post-traduccionales El uso de espectrometría de masas de abajo hacia arriba: A partir de la histona Extracción de Análisis de Datos

Este protocolo describe la reconstitución de los nucleosomas que contienen histonas hermana marcados con isótopos diferencialmente. Al mismo tiempo, los nucleosomas asimétricamente después de la traducción modificados pueden ser generados después de usar una copia de la histona premodified. Estas preparaciones se pueden utilizar fácilmente para estudiar los mecanismos de modificación de diafonía, simultáneamente en ambos histonas hermanas, mediante el uso de la espectroscopia de RMN de alta...

La reconstitución de los nucleosomas con histonas hermanas marcadas con isótopos diferencialmente

Este manuscrito describe métodos para aplicar la tecnología de microarrays de péptidos a la especificidad de perfiles de anticuerpos que reconocen las histonas y sus modificaciones post-traduccionales.

Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

Aquí, describimos un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina de histonas modificadas de la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated ADN se utiliza posteriormente para PCR cuantitativa para interrogar la abundancia y localización de modificaciones post-traduccionales de las histonas por todo el genoma.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo describe una batería de métodos que incluye cromatografía analítica de exclusión de tamaño para estudiar la oligomerización y estabilidad de la chaperona de histonas, ensayo de extracción hacia abajo para desentrañar las interacciones chaperona-histona de histonas, AUC para analizar la estequiometría de los complejos de proteínas y ensayo de acompañamiento de histonas para caracterizar funcionalmente una chaperona de histonas putativa in vitro.

In vitro Caracterización de chaperonas de histonas mediante ensayos analíticos, pull-down y acompañantes

Un flujo de trabajo analítico basado en cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para un análisis "ascendente" de alta confianza y altamente reproducible de las modificaciones e identificación de histonas en función de los parámetros principales (tiempo de retención [RT], sección transversal de colisión [CCS] y relación masa-carga [m/z] precisa).

Cribado de modificación de histonas mediante cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Este artículo presenta un procedimiento experimental detallado para la reconstitución de ataduras de ADN que contienen nucleosomas para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula. Además, describe varios experimentos posteriores que se pueden llevar a cabo para visualizar el comportamiento de unión de las proteínas que interactúan con la cromatina y analizar los cambios en las propiedades físicas de los nucleosomas.

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

El enriquecimiento y secuenciación del ADN naciente asociado a proteínas (eSPAN) se desarrolló para detectar la abundancia relativa de una proteína asociada a la cromatina en dos cadenas de ADN replicantes, revelando así una visión molecular sobre la replicación de la cromatina y sus procesos acoplados. Este protocolo describe los procedimientos eSPAN en células madre embrionarias (ES) de levaduras y ratones.

Análisis específico de hebras de proteínas en cadenas replicantes de ADN mediante el enriquecimiento y secuenciación del método de ADN naciente asociado a proteínas

Aprende a identificar sustratos de unión de SPIN4 mediante matrices peptídicas y pulldown de nucleosomas nativos. Este protocolo permite caracterizar lectores de histonas implicados en regulación del crecimiento óseo.

Identificación de histonas modificadas como sustratos de unión del miembro 4 de la familia de la espiglina humana (SPIN4) mediante matrices peptídicas y pulldown nativo de nucleosomas (Video) | JoVE Journal

Identificación de histonas modificadas como sustratos de unión del miembro 4 de la familia de la espiglina humana (SPIN4) mediante matrices peptídicas y pulldown nativo de nucleosomas

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