Un método optimizado para aislar el epitelio uretral femenino de ratón para análisis unicelular e inmunofluorescencia

Nuestro grupo está interesado en estudiar el patrón epitelial en el tracto genitourinario. Este protocolo representa un método optimizado para aislar el revestimiento epitelial de la uretra femenina del ratón para análisis moleculares y celulares posteriores. Los métodos descritos en este artículo ayudarán en la investigación sobre el revestimiento uretral femenino y su papel en la defensa inmunitaria.

Para empezar, coloca a la ratona femenina del CD1 eutanasiada, de entre 6 y 12 semanas de edad, en posición supina sobre la mesa de disección. Rocía etanol al 70% en el abdomen para mojar el pelo. Con pinzas, levanta la piel del abdomen.

Luego, con unas tijeras pequeñas, haz una incisión vertical hacia la parte inferior del cuerpo, terminando en la abertura uretral externa. Identifica la vejiga y levántala suavemente con pinzas, asegurándote de que esté vacía y libre de orina. Con tijeras, recorta la grasa y el tejido conectivo alrededor de la vejiga para exponer la estructura en forma de mariposa donde se unen los dos huesos púbicos en la sínfisis púbica.

Observa la uretra que pasa por debajo de la sínfisis púbica. Luego levanta la sínfisis púbica con pinzas y córtala con unas tijeras. Retira los fragmentos del hueso púbico para exponer la fina uretra situada en la superficie ventral de la pared vaginal.

Con pinzas finas, tira suavemente de la vejiga hacia arriba desde la cavidad corporal. Coloca tijeras entre la uretra y la pared vaginal para separar los tractos urinario y reproductor. Mantén una ligera tensión en la vejiga mientras cortas a lo largo de la parte posterior de la uretra para separarla de la pared vaginal.

Continúa cortando hasta la abertura uretral distal para obtener la uretra de ratón de longitud completa, que mide entre 1,2 y 1,5 centímetros de longitud. A continuación, separa la uretra de la vejiga haciendo un solo corte en el cuello de la vejiga. Agrupar cuatro o cinco uretras en una placa de Petri estéril que contenga HBSS fresco, libre de calcio y magnesio.

Bajo un microscopio de disección, recorta la grasa y el tejido conectivo que rodea la uretra usando pinzas de punta fina y tijeras. Luego, con tijeras, corta cada uretra transversalmente en dos piezas de igual tamaño. Coloca las piezas de papel de seda sobre un colador de malla de nylon de 100 micras.

Lava los trozos de tejido con un mililitro de HBSS y luego transfiere a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de tripsina al 1% preparado en HBSS suplementado con antibióticos y antimicróticos. A continuación, incuba la muestra en un rotador a 30 revoluciones por minuto y cuatro grados Celsius durante 15 a 30 minutos. Tras la digestión, añade 10 milimolares de cloruro de magnesio preparado en HBSS al tubo, seguido de 10 microgramos por mililitro de DNAsa I preparada en PBS.

Incuba el tubo durante 15 a 30 minutos en un rotador colocado dentro de un horno de hibridación a 37 grados Celsius. Para apagar la tripsina, transfiere los tejidos uretrales a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene un 10% de suero de oveja en HBSS a temperatura ambiente. Tras cinco minutos, transfiere los tejidos uretrales a un nuevo tubo que contenga HBSS bien frío, y luego a una placa de Petri estéril con HBSS helado.

Mientras observas la muestra bajo un microscopio, sujeta un extremo de la pieza uretral con un par de pinzas. Con otro par de pinzas, pasa a lo largo de toda la longitud de la pieza uretral para extruir la lámina epitelial transparente. Procesa algunas de las láminas epiteliales uretrales aisladas directamente para la inmunotinción de montaje completo y así visualizar las células epiteliales y los macrófagos asociados a la epitelia in situ.

Utiliza una pequeña pipeta de plástico para transferir las piezas epiteliales en una gota de HBSS aislada de cuatro a cinco uretras de ratón agrupadas a una placa de Petri estéril. Usa tijeras para picar el epitelio en pequeños fragmentos. Transfiere los fragmentos epiteliales picados a un tubo microcentrífuga de dos mililitros que contenga 1,5 mililitros de solución digestiva de Accutasa precalentada a 37 grados Celsius.

Incuba la muestra en un rotador a 37 grados durante una hora. Tras la incubación, transfiere todo el contenido a un tubo centrífuga de cinco mililitros que contiene dos mililitros de tampón de lavado compuesto de 1X PBS libre de calcio y magnesio y 1% de BSA. Centrifuga la suspensión a 600 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius usando un rotor de cubo oscilante.

A continuación, aspira el sobrenadante usando un vacío suave. Luego usa una pipeta con punta de filtro de un mililitro para resuspender el pellet en un mililitro de tampón de lavado. Rompe el pellet pipeteando arriba y abajo hasta que los grumos se hagan más pequeños.

Pasa la suspensión por agujas de calibre 23,5 y 26,5, cada una unida a una jeringuilla de un mililitro usando cuatro carreras por aguja. A continuación, añade un mililitro de tampón de lavado para humedecer la superficie de un filtro de preseparación de 30 micras colocado sobre un tubo de cinco mililitros. Usando la jeringuilla conectada a la aguja de calibre 26,5, transfiere un mililitro de la suspensión de la celda a través del filtro.

Luego lava el tubo con un mililitro de tampón de lavado y pásalo por el filtro. Pelletar las celdas mediante centrifugación a 600 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius usando un rotor de cubo oscilante. Aspira el sobrenadante.

Resuspende el pellet en 100 microlitros de tampón de lavado y añade 100 microlitros de tampón de lisis de glóbulos rojos. Después de exactamente tres minutos, añade cuatro mililitros de buffer de lavado y mezcla. Cosechar las celdas mediante centrifugación a 600 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius usando un rotor oscilante de cubo.

Retira el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en 50 a 200 microlitros de buffer de lavado, dependiendo del tamaño del pellet. Mezcla una aliteracia de cinco microlitros de células con cinco microlitros de azul de tripán y carga la mezcla en un hemocitómetro para evaluar el rendimiento y la viabilidad celular. Evalúa la viabilidad celular y cuantifica poblaciones celulares distintas utilizando citometría de flujo.

Cultivar células epiteliales uretrales individuales en una matriz de membrana basal y medios de expansión organoides para generar organoides epiteliales uretrales tridimensionales. Realizar tinción por eosina por hematoxilina e inmunotinción fluorescente en secciones organoides incrustadas para visualizar la estructura organoide y la composición celular. Las vainas epiteliales uretrales aisladas tenían una mayor transparencia que el tejido estromal tras la separación.

La inmunotinción de montajes completos de las vainas epiteliales mostró un marcaje fuerte con el anticuerpo E-cadherin CDH1. El marcado de las láminas con el anticuerpo contra F480 mostró cómo los macrófagos formaban estructuras dendríticas ramificadas entre las células epiteliales de la uretra. Las células individuales aisladas del epitelio uretral mostraron una viabilidad consistentemente alta mediante exclusión de azul de tripán en un hemocitómetro y citometría de flujo utilizando el colorante fantasma reactivo a aminas V 450.

Las células aisladas contenían una población epitelial enriquecida tras la entrada de las células vivas. Se observaron aproximadamente el 1,3% de las células inmunitarias CD45 positivas y el 1,18% de macrófagos en suspensiones unicelulares. Las células epiteliales individuales aisladas de la uretra permanecieron viables y formaron organoides en una matriz tridimensional, observando crecimiento de organoides hasta el día seis en cultivo.

La tinción con eosina por hematoxilina mostró dos morfologías distintas de los organoides epiteliales uretrales, incluyendo organoides grandes y huecos y organoides sólidos más pequeños. Tanto los organoides epiteliales huecos como los sólidos de la uretra estaban estratificados y expresaban KRT5 y P63 en la capa basal. Expresaron KRT-13 en las capas celulares suprabasal e intermedia.

Los organoides generados por la uretra proximal mostraron una mayor proporción de organoides huecos, mientras que los organoides de la uretra distal formaron esferas más sólidas. Este protocolo permite a los investigadores estudiar los tipos de células uretrales y la capacidad autorrenovable de las células epiteliales desde la uretra proximal y distal. Una de las consideraciones más importantes de este protocolo es la disección cuidadosa de la uretra de longitud completa y la digestión enzimática óptima para obtener células epiteliales uretrales viables para análisis posteriores.

Las células epiteliales producidas por este protocolo pueden utilizarse para múltiples aplicaciones, incluyendo la secuenciación de ARN unicelular, la secuenciación de ARN a granel, la citometría de flujo, la inmunotinción y el cultivo de organoides.