Un modelo integral de ratas para evaluar las vías de transporte hepático mediante muestreo simultáneo de vasculedades linfáticas y hematobacterias

Nuestro laboratorio estudia el papel del sistema linfático en las enfermedades inflamatorias y cardiometabólicas y desarrolla estrategias de administración de fármacos para atacar a los linfáticos y tratar estas enfermedades. Este protocolo permite evaluar procesos hepáticos, incluyendo el metabolismo de fármacos, el flujo de nutrientes, la señalización inmunitaria y la respuesta hepática bajo diversas condiciones. Para empezar, coloca un macho de rata Sprague-Dawley anestesiada que pesa aproximadamente 250-300 gramos y que ha sido canalizado con éxito a través de la arteria carótida y la vena yugular en recumbencia dorsal bajo un microscopio quirúrgico.

Realiza una incisión horizontal de 4-5 centímetros desde la línea media hasta el flanco derecho, aproximadamente entre 1,5 y 2 centímetros por debajo de la caja torácica. Retrae la piel y realiza incisiones iguales en los músculos oblicuos externos e internos. Cauteriza o liga cualquier vaso sanguíneo grande que encuentres durante el procedimiento.

Utiliza hisopos de algodón humedecidos con solución salina para mover el hígado hacia el diafragma, el estómago a la izquierda y el intestino delgado hacia abajo. Mantén los órganos retraídos con gasas empapadas en solución salina. Identificar el conducto linfático hepático que discurre paralelo y ligeramente caudal a la arteria hepática, medial al riñón derecho y adyacente a la vena cava inferior.

Utiliza el conducto linfático mesentérico opaco o blanco más grande como punto de referencia anatómico para identificar el conducto linfático hepático translúcido y estrecho situado caudalmente. Utiliza pinzas Graefe rectas para eliminar el tejido conectivo que cubre el conducto linfático y la vena cava. Introduce las pinzas a través del lecho graso bajo el riñón derecho para crear un túnel bajo la vena cava.

Avanza las pinzas hasta que las puntas emergan paralelas al conducto linfático hepático en el lado opuesto de la vena cava. Utiliza las pinzas para agarrar el extremo externo de la cánula ya preparada y tira de la cánula a través del túnel hasta que su punta salga por el lado opuesto. Utiliza la pinza hemostática de mosquito Halsted para doblar la punta de una aguja calibre 25 aproximadamente a 90 grados.

Con la aguja doblada, perfora cuidadosamente el conducto linfático hepático en el lado derecho más cercano al operador. Revisa la cánula prellena con solución anticoagulante y elimina las burbujas de aire, si las hay. Inserta el extremo biselado aproximadamente 2 milímetros dentro del conducto.

Confirmar el flujo linfático en el extremo externo de la cánula en aproximadamente 100 microlitros por hora. Ajusta o vuelve a insertar la cánula si no se observa flujo. Tapa la cánula en el extremo de la recogida y luego aplica una pequeña gota de adhesivo veterinario para asegurar el lugar de inserción.

Una vez seco el adhesivo, confirma el flujo linfático a través del tubo. Después, retira la gasa y devuelve los órganos a sus posiciones originales. Coloque el tubo de recogida que contiene la solución anticoagulante debajo de la salida de la cánula y confirme que la linfa fluye gota a gota hacia el tubo.

Luego cierra la pared abdominal suturando secuencialmente las capas oblicua interna, oblicua externa y cutánea. Inmediatamente después de la canulación linfática hepática, inicia la rehidratación infundiendo solución fisiológica estéril a 1,5-3,0 mililitros por hora a través de la cánula de la vena yugular. Monitoriza la respiración y los reflejos mientras mantienes la anestesia mediante un cono nasal.

Tras la dosificación terapéutica a través de la cánula de la vena yugular, se recoge la linfa hepática de forma continua en tubos que contienen solución anticoagulante. Cambia los tubos de recogida cada hora o según sea necesario. Recoger muestras de sangre de la arteria carótida en los momentos designados, manteniendo el volumen total por debajo del 10% del volumen sanguíneo circulante estimado antes de la toma de muestras terminales.

Reabrir la incisión abdominal para exponer la cavidad superior abdominal manteniendo la anestesia profunda y la respiración estable. Utiliza gasas humedecidas con solución salina para retraer suavemente el hígado hacia el diafragma, el estómago a la izquierda y el intestino delgado hacia abajo. Identificar la arteria hepática que discurre paralela al conducto linfático hepático situado junto al conducto linfático mesentérico.

Obtén una cánula de polivinilo con un diámetro exterior de 0,61 milímetros y un diámetro interior de 0,28 milímetros pre-llena con una solución anticoagulante y elimina cualquier burbuja de aire. Usando pinzas de iris curvadas, aísla un segmento corto de la arteria hepática. Coloca una sutura de seda 4-0 bajo la arteria.

Levanta suavemente la arteria y coloca una segunda sutura distal a la primera. Ata la sutura distal para controlar el reflujo mientras deja la sutura proximal sin atar para su cierre posterior. Con tijeras micro de punta fina, realiza una pequeña incisión transversal de aproximadamente 0,5 milímetros en la pared arterial entre las suturas.

Utiliza la punta de las pinzas Dumont para levantar la colpa del vaso y estabilizar la luz del vaso para la inserción de la cánula. Inserta el extremo biselado de la cánula de polivinilo en la abertura y avanza la cánula aproximadamente 2-3 milímetros. Asegura la cánula atando la sutura proximal alrededor tanto del vaso como de la cánula.

Confirma la colocación correcta aspirando suavemente una pequeña cantidad de sangre arterial roja brillante. Recoge entre 0,5 y 1 mililitro de sangre en un tubo premarcado que contenga anticoagulante. La recuperación linfática de terapias macromoleculares administradas por vía intravenosa en la linfa torácica, hepática y mesentérica demuestra la utilidad del modelo para evaluar el transporte linfático.

La linfa hepática tiene un contenido total de lípidos notablemente menor que la linfa torácica y mesentérica, mientras que su concentración de proteínas es comparable a la de otras fuentes linfáticas. Este protocolo permite mediciones simultáneas de la linfa hepática y la sangre para evaluar el transporte, metabolismo y eliminación de moléculas, incluyendo fármacos, nutrientes y señales. La canulación precisa del conducto linfático hepático es técnicamente compleja y requiere una identificación anatómica cuidadosa y técnica quirúrgica.

Estudios futuros pueden utilizar esta técnica para mapear el transporte, la eliminación y el metabolismo hepático, avanzando en la comprensión de las enfermedades hepáticas y las terapias dirigidas.