Un método integrado para el modelado fototrombótico del ictus y el registro in vivo de la actividad neuronal y astrocítica en ratones en comportamiento

Nuestra investigación desarrolla un método integrado para registrar simultáneamente la actividad de astrocitos y neuronas durante un accidente cerebrovascular isquémico en ratones conscientes. Los métodos anteriores registraban neuronas o astrocitos por separado. Nuestro protocolo capta señales de astrocitos y neuronas simultáneamente desde los primeros momentos del inicio del accidente cerebrovascular.

Para comenzar, transfiera un ratón C57BL/6J profundamente anestesiado al marco estereotáxico equipado con una máscara de anestesia. Monitoree la profundidad de la anestesia cada 10 minutos mientras mantiene la temperatura corporal del ratón entre 36 y 37,5 grados Celsius mediante una alfombra calefactora con control de retroalimentación. Sujete al ratón al marco estereotáxico con barras auriculares y una barra bucal después de aplicar una pomada oftálmica en los ojos.

Confirme la inmovilización de la cabeza mediante una sonda suave una vez que la cabeza esté fijada simétricamente. Después de la depilación y la preparación séptica de la piel, use tijeras quirúrgicas para realizar una incisión en la línea media. Limpie el periostio con solución salina y torundas de algodón para exponer el bregma y el lambda.

Baje la micropipeta de vidrio para tocar sucesivamente el bregma y el lambda. Después de anotar la coordenada Z en el vernier digital, ajuste la barra bucal hasta que la diferencia sea inferior a 0,04 milímetros. Baje la micropipeta de vidrio para tocar el bregma y restablezca el vernier digital a cero.

Mueva la micropipeta 2,3 milímetros sucesivamente hacia la izquierda y hacia la derecha de la bregma. Después de anotar la coordenada Z, ajuste las barras oticas hasta que las diferencias bilaterales sean menores a 0,04 milímetros. Tras restablecer el vernier digital a cero en la bregma, marque el área de la corteza motora del miembro anterior en 1,5 milímetros anterior-posterior y 0,74 milímetros medial-lateral.

Utilice un microtaladro y brocas de punta redonda de 0,5 milímetros para perforar un pequeño orificio, de aproximadamente 0,5 milímetros de diámetro, en la ubicación marcada. Antes de cargar, mezcle los dos vectores virales adenoasociados en volúmenes iguales y centrifugue brevemente la muestra. Baje la micropipeta de vidrio conectada a la bomba de microinfusión hasta el sitio objetivo a una profundidad dorsal-ventral de menos 0,94 milímetros desde la superficie del cerebro.

Infundir 400 nanolitros de la mezcla viral que contiene 200 nanolitros de cada vector a 50 nanolitros por minuto. Retirar lentamente la pipeta 10 minutos después de finalizada la infusión. Suture el cuero cabelludo con una sutura 4-0 de 20 milímetros, arco de 3/8, y coloque al ratón sobre una almohadilla calefactora hasta su recuperación completa.

Tres a cuatro semanas después de la inyección viral, siga el procedimiento previamente descrito hasta la incisión del cuero cabelludo. Durante la incisión, retire un fragmento de cuero cabelludo de 1,5 centímetros por 1,5 centímetros, conservando suficiente piel alrededor de los ojos. Limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno y solución salina al 0,9 %.

Después de identificar el bregma, restablezca el vernier digital a cero. Utilice una broca redonda de 0,8 milímetros para raspar ligeramente la superficie del cráneo. Marque el área de la corteza motora del miembro anterior.

En anterior-posterior, 1,5 milímetros y en medial-lateral, 0,74 milímetros. Utilice esta marca como punto central para dibujar un cuadrado de cinco milímetros por cinco milímetros. Use un microtaladro a aproximadamente 10.000 revoluciones por minuto para trazar el cuadrado.

Aplique continuamente solución salina helada al trayecto de la fresa y deténgase inmediatamente si el colgajo óseo se afloja. Taladre tres pequeños orificios de 0,5 milímetros de diámetro sobre el hemisferio contralateral y el cerebelo. Implante tornillos de craneoplastia en los orificios.

Asegúrese de que cada tornillo alcance la duramadre pero no penetre más para evitar dañar el tejido cerebral. Utilice pinzas para retirar la escotadura ósea suelta. Use pinzas ultrafinas con una punta ultrafina menor de 0,03 milímetros por 0,01 milímetros para eliminar la duramadre en la ventana craneal, evitando el contacto directo con el tejido cerebral.

Fije el optrodo al brazo del micromanipulador del marco estereotáxico y muévalo por encima de la ventana craneal. Entrelace firmemente los cables plateados de tierra y de referencia del optro a los tres tornillos de craneoplastia. Limpie la superficie de la ventana craneal con solución salina estéril.

Baje lentamente el optrodos hasta la profundidad dorsoventral deseada de menos 0,94 milímetros a una velocidad de un milímetro por cada 10 segundos. Aplique una capa de agarosa sobre la ventana craneal después del implante. Aplique tres o cuatro capas de cemento dental.

Una vez que el cemento dental se solidifique, administre analgesia durante tres a cinco días y permita que el ratón se recupere durante una a dos semanas. Utilice un sistema de fotometría de fibra de doble o triple longitud de onda para excitar GCaMP6s. Establezca el canal de señal en 470 nanómetros y el canal de control en 410 nanómetros.

Ajuste la frecuencia de muestreo a 60 cuadros por segundo. Ahora, conecte a tierra adecuadamente todos los componentes del sistema de grabación. Utilice una referencia mediana común durante la grabación.

Verifique que las señales de banda amplia y potenciales de campo locales estén seleccionadas en el software de grabación mientras monitorea el ruido durante toda la sesión de grabación. Después de anestesiar brevemente al ratón, conecte el optrodo a la línea de grabación mediante un adaptador. Coloque al ratón en un entorno similar a su jaula de alojamiento para la grabación.

Permita 10 minutos de aclimatación después del despertar. Registre al ratón realizando la prueba de fuerza de agarre, requiriendo un tirón por minuto durante cinco minutos. Marque con sello de tiempo preciso las pruebas conductuales tanto en sistemas multicanal como en sistemas de fotometría de fibra.

Administre una solución de verde de bengala al 1,5 % por vía intraperitoneal a una dosis de 10 a 20 miligramos por kilogramo y espere cinco minutos. Conecte la sonda optrodal a la fuente láser una vez alcanzada y mantenida la anestesia profunda. Aplique un haz láser de 530 nanómetros a 15 milivatios a través del optrodo implantado durante cinco a ocho minutos para inducir isquemia focal.

Para realizar la estimulación optogenética, conecte el estimulador láser al optrod. Encienda el estimulador láser optogenético de 488 nanómetros y ajústelo a 10 milivatios durante cinco minutos para Opto-vTrap. Finalmente, coloque al ratón sobre una almohadilla calefactora para su recuperación.

En comparación con la línea base, el flujo sanguíneo cerebral disminuyó después de la fototrombosis y permaneció suprimido a un día y siete días después del accidente cerebrovascular. La fuerza de prensión de las extremidades anteriores mostró una disminución altamente significativa a un día y permaneció suprimida a siete días después del accidente cerebrovascular. Los transitorios de calcio en astrocitos registrados mediante fotometría de fibra y los potenciales de acción neuronales obtenidos mediante electrofisiología se alinearon según las marcas de tiempo.

Tras el accidente cerebrovascular foto trombótico, las tasas de disparo se vieron significativamente suprimidas tanto en neuronas piramidales como en interneuronas, en comparación con la actividad basal durante la tarea de agarre del miembro anterior. En condiciones basales, los transitorios de calcio en astrocitos alcanzaron su pico entre cuatro y seis segundos tras el inicio de la tarea. Sin embargo, la amplitud se redujo significativamente tras el accidente cerebrovascular foto trombótico, lo que refleja una actividad de calcio debilitada.

Los gráficos de raster y los histogramas periestimulares mostraron cambios en la actividad neuronal durante la estimulación óptica. Tanto la frecuencia de disparo de las neuronas piramidales como la de las interneuronas mostraron una disminución significativa tras la estimulación óptica en comparación con la línea base previa al estímulo, lo que confirma que la modulación astrocitaria tiene un efecto medible descendente sobre la excitabilidad del circuito local. Este protocolo permite la grabación ininterrumpida del ejercicio y la neuroactividad a lo largo de la línea temporal previa al ictus, desde la fase aguda hasta la crónica.

El éxito de este protocolo depende de una alineación precisa o coordinada. La implantación óptica monocular y la expresión viral suficiente son factores temporales cruciales durante las cirugías. En estudios futuros se podrían utilizar múltiples implantes para monitorear regiones cerebrales más amplias o dirigirse a diferentes tipos celulares mediante ensayos conductuales diversos.