Un sistema microfluídico para modelar la disfunción endotelial bajo esfuerzo fisiológico combinado de cizalladura pulsátil e hiperglucemia oscilatoria

Este estudio investiga cómo la hiperglucemia oscilatoria sincronizada y el esfuerzo de cizalladura pulsátil impulsan juntos la disfunción endotelial en la enfermedad vascular diabética. Los modelos existentes utilizan glucosa alta inicial o flujo laminar constante. Investigamos cómo el esfuerzo cortante pulsátil contrarresta la lesión oscilatoria de glucosa.

Para empezar, utiliza software de diseño asistido por ordenador para diseñar la estructura del chip microfluídico. Haz el molde maestro del SU-8 a través de una empresa comercial. En una taza limpia, mezcla el agente de curado de polidimetilsiloxano y el prepolímero en una proporción de 10:1 en peso y remueve vigorosamente la mezcla a mano durante cinco minutos.

Luego coloca el recipiente en una cámara de vacío a una presión de 0,08 megapascal durante al menos 15 minutos para eliminar las burbujas de aire atrapadas durante la mezcla. Vierte el polidimetilsiloxano sobre la oblea colocada en una placa de Petri de vidrio. Desgasifica el polidimetilsiloxano vertido sobre la oblea en un desecador durante 15 minutos adicionales para eliminar las burbujas formadas durante la fundición.

Coloca la placa de Petri que contiene el molde y el polímero en un horno caliente a 80 grados Celsius durante dos horas. Con un bisturí, despega cuidadosamente la losa de polímero solidificada del molde maestro. Utilizando una herramienta perforadora de núcleo, crea los puertos de entrada y salida en los extremos designados del canal en la losa de polímero.

Limpia la capa de cristal y la cara con patrón de la losa de polímero con cinta adhesiva. A continuación, trata tanto la losa de polímero como la capa de cristal con un limpiador de plasma a 65 vatios bajo aire ambiente durante 60 segundos. Alinea inmediatamente la cara del canal polimérico con el lado tratado del barbotín de la cubierta de vidrio.

Luego presiona suavemente para crear un canal microfluídico permanentemente cerrado. Coloca el chip microfluídico enlazado en una botella de vidrio boronizado llena de agua desionizada. Esteriliza mediante autoclav a 121 grados Celsius y 15 libras por pulgada cuadrada durante 20 minutos.

Coloca el chip esterilizado en un recipiente de cultivo de 60 milímetros lleno con una mezcla equimolar de PBS y DMEM de baja glucosa. Luego, usando una jeringuilla de un mililitro, introduce 100 microgramos por mililitro de fibronectina en el canal e incuba a 37 grados Celsius durante cuatro horas. A continuación, añade 24,5 milimolares de demanitol a DMEM de glucosa baja para aumentar la presión osmótica.

Añadir cinco milimolares de D-glucosa a un DMEM de glucosa alta para obtener una concentración final de 30 milimolares. Prepara un medio de cultivo de glucosa normal y un medio de cultivo de glucosa alta suplementados con 20% de FBS y 1% de penicilina estreptomicina. Luego calienta PBS, tripsina, medio de cultivo de glucosa normal y medio de cultivo de glucosa alta en un baño maría a 37 grados Celsius.

Extrae las células endoteliales de la vena umbilical humana del plato de cultivo con una confluencia del 90%. Desacopla las células usando una solución al 0,25% de tripsina-EDTA. Tras incubar las células a 37 grados Celsius durante 30 segundos, cuenta las células extraídas y resuélvelas por separado en glucosa normal y medios de glucosa alta a una concentración de 1 por 10 a la potencia de 6 células por mililitro.

Utilizando una jeringuilla de un mililitro, inyecta 100 microlitros de la suspensión celular en el puerto de entrada del chip microfluídico con medio glucosa normal para el grupo control y medio de glucosa alta para el grupo experimental. Coloca los chips microfluídicos en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Calcular el caudal necesario para alcanzar el esfuerzo cortante pulsátil objetivo utilizando la ecuación presentada.

Conecta la fuente de presión al controlador de presión. Luego conecta el controlador de presión al controlador de válvulas conectado al ordenador para el control automatizado de las formas de onda de presión. Llena dos depósitos de 100 mililitros, uno con medio de cultivo de glucosa normal y otro con medio de cultivo de alta glucosa.

Conecta los depósitos a los canales correspondientes del controlador de presión. Luego conecta los depósitos y la válvula magnética de tres vías de dos posiciones usando tubería de silicona. Establezca el esfuerzo de cizallamiento pulsátil fisiológico objetivo correspondiente a un caudal de aproximadamente 200 microlitros por minuto.

Programar la bomba de aire programable para generar una función de onda sinusoidal que mantenga la tensión cortante pulsátil. A continuación, programa el controlador de válvulas para que cambie de canal cada cinco minutos y así generar una oscilación de glucosa de onda cuadrada durante la estimulación dinámica. Conecta la válvula magnética de tres vías de dos posiciones y el chip microfluídico usando tubería de silicona.

Luego inicia el sistema de bomba programable para cebar la tubería. A continuación, usando los conectores de acero inoxidable con ángulo de 90 grados de diámetro y 1,3 milímetros, conecta los puertos de entrada y salida del chip microfluídico al tubo. Conecta la salida del chip microfluido al depósito de residuos y luego vuelve a poner la bomba en marcha para suministrar una tensión de cizalladura oscilatoria combinada de glucosa y pulsátil durante un total de 30 minutos.

Tras realizar la verificación del campo de flujo, preparar la solución de trabajo de calceína AM y yoduro propidio según las instrucciones del fabricante en el punto final experimental. Una vez que el canal se ha enjuagado una vez con PBS, introduce la solución de trabajo de calceína AM y yoduro propidio en el canal e incuba a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos en la oscuridad. Captura inmediatamente imágenes fluorescentes de las células teñidas usando un microscopio de fluorescencia invertida equipado con una lente objetivo de 10 veces.

Captura inmediatamente imágenes fluorescentes de las células teñidas usando un microscopio de fluorescencia invertida equipado con una lente objetivo 10x. Utiliza el filtro verde de isotiocianato de fluoresceína para la AM de calceína y el filtro rojo de tetrametilrodamina o rodamina para yoduro de propidio. Tras enjuagar el canal tres veces con PBS, introduce la solución fluorescente fluorescente de estrés oxidativo de célula viva en el canal e incuba como se ha demostrado anteriormente.

Lava el canal tres veces con PBS para retirar la sonda no atada. Captura inmediatamente imágenes fluorescentes usando el filtro rojo lejano configurado a través de una lente objetiva de 20x manteniendo parámetros de exposición idénticos en todos los grupos. Abre las imágenes adquiridas de calceína AM verde y yoduro de propidio rojo en ImageJ.

Ajusta manualmente el umbral de cada canal para distinguir las señales fluorescentes del fondo. Utiliza el contador de células para cuantificar las células fluorescentes, ajustando el tamaño mínimo de la célula en función de las observaciones para determinar el recuento de células vivas y muertas en múltiples campos de visión. Calcula el porcentaje de células vivas usando un software de hoja de cálculo para cada condición experimental.

Luego calcula la media y la desviación estándar en múltiples campos de visión usando software de análisis estadístico para comparar grupos. Arrastra la imagen que elegiste a ImageJ. Selecciona Analizar y selecciona Establecer escala para calibrar el tamaño del píxel usando los metadatos del microscopio.

Luego, elimina la señal uniforme de fondo inespecífica de toda la imagen usando la función de resta de fondo seleccionando Procesar y seleccionando Restar fondo. A continuación, selecciona Imagen y selecciona Ajustar seguido de Umbral para ajustar manualmente el deslizador de umbral y definir la señal intracelular de especie reactiva de osígeno. Establece las medidas seleccionando Analizar y seleccionando Conjunto de Medidas para incluir Área y Valor gris medio.

Selecciona Analizar y Analizar Partículas para determinar el tamaño mínimo de la célula en función de las dimensiones observadas y medir la intensidad media de la señal segmentada dentro del ROI de la monocapa de la celda. Informa el nivel de especies reactivas de oxígeno para cada condición experimental como la media de los valores medidos derivados de al menos tres campos de visión seleccionados aleatoriamente por chip. Introduce los resultados cuantitativos en el software de análisis de datos y gráficos gráficos.

Determinar la significación estadística comparando grupos experimentales con el grupo control mediante análisis bidireccional de la varianza seguido de la prueba post-hoc de Tukey con un nivel de significación de 0,05. Utiliza el software para realizar el análisis y genera gráficos con barras de error que representan la desviación estándar. Las imágenes representativas de fluorescencia mostraron una alta proporción de células viables en todos los grupos, con una muerte celular despreciable observada en la glucosa normal y la glucosa normal con grupos de esfuerzo de corte pulsátil, mientras que la glucosa oscilatoria y la glucosa oscilatoria con grupos de esfuerzo de corte pulsátil mostraron un aumento visible de células muertas.

El análisis cuantitativo mostró que la exposición a glucosa oscilatoria resultó en una reducción significativa de la viabilidad celular en comparación con el grupo control, y que la aplicación de esfuerzos de cizallamiento pulsátil bajo condiciones de glucosa oscilatoria aumentó significativamente la viabilidad en comparación con la glucosa oscilatoria sola. En condiciones normales de glucosa, los niveles intracelulares de especies reactivas de oxígeno eran bajos y se redujeron aún más tras la aplicación de estrés cortante. Mientras que las condiciones oscilatorias de glucosa provocaron un aumento marcado en la intensidad de la fluorescencia roja, lo que indica un aumento de especies reactivas de ogénio.

El aumento inducido por glucosa oscilatoria en las especies reactivas intracelulares de ogénigeno se redujo tras la aplicación de esfuerzos cortantes. El análisis cuantitativo reveló que el estrés cortante redujo significativamente los niveles de especies reactivas de oxígeno en condiciones normales de glucosa. En contraste, las condiciones de glucosa oscilatoria provocaron un aumento significativo en los niveles de especies reactivas de oxígeno en comparación con la glucosa normal.

Además, el esfuerzo cortante disminuyó significativamente los niveles de especies reactivas de oxígeno, incluso bajo condiciones oscilatorias de glucosa. Este protocolo permite cuantificar los niveles de ROS y la disponibilidad celular para estudiar la disfunción endotelial bajo hiperglucemia oscilatoria y el esfuerzo de corte pulsátil. Tras este procedimiento, se puede realizar análisis molecular, como la vía NRF2 o la señalización iNOS, para enuclear los mecanismos de protección endotelial.

Futuros estudios podrían utilizar este sistema para explorar vías mecanobiológicas, incorporar geometrías de alteración del flujo o co-cultivo de células musculares lisas.