Caracterización de las sondas de Riboglow in vitro como base para la imagen de vida por fluorescencia en células vivas de mamíferos y modelos celulares tridimensionales
4 de agosto de 2026
El objetivo de este protocolo es permitir la medición cuantitativa de la vida útil de fluorescencia de sondas Riboglow para flujos de trabajo de imagen de ARN reproducible in vitro, en células vivas de mamíferos y en modelos celulares tridimensionales. Detallamos los flujos de trabajo de preparación de la muestra, entrega de la sonda, adquisición de datos y análisis cuantitativo para extraer mediciones de vida útil de fluorescencia sesgadas.
Nuestra investigación se centra en visualizar el ARN en células vivas para investigar la dinámica espacio-temporal del ARN. La plataforma Riboglow utiliza microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia cuantitativa en sistemas multicelulares aplicables a sistemas biológicos en salud y enfermedad. Para comenzar, obtenga las muestras de ARN o células con sondas Riboglow cargadas con cuentas.
Encienda el sistema de microscopio confocal de exploración láser seguido de la unidad de control del microscopio. Encienda el sistema de microscopía de tiempo de vida de fluorescencia basado en conteo de fotones únicos correlacionados en el tiempo o microscopía FLIM, incluyendo la unidad de combinación de láser, el detector de fotomultiplicador y el temporizador de eventos. Después de abrir el software de adquisición y análisis de imágenes NIS, en la ventana de configuración y ajuste, seleccione AX con PicoQuant.
Una vez que el software se haya iniciado, seleccione AX FLIM y FCS. Para configurar el microscopio para la adquisición de datos de tiempo de vida de fluorescencia, confirme que Galvano esté seleccionado en la sección AX pad. Establezca el valor de promedio en uno y el tiempo de permanencia en dos.
En la sección de potencia del láser, baje los controles deslizantes individuales del láser al 3-4%. Establezca el control deslizante de todos los láseres en uno. Después de seleccionar el objetivo de 20X, en la configuración del área de escaneo, seleccione 512 por 512 y active los detectores. Para definir la ruta del archivo de datos, vaya a la parte inferior de la sección del controlador y seleccione configurar.
Después de hacer clic en la pestaña PicoQuant o FLIM FCS, debajo de la ruta del espacio de trabajo, seleccione el símbolo de carpeta a la derecha. En la ubicación de almacenamiento, cree una nueva carpeta para los experimentos del día y cierre la ventana de configuración. Una vez que se selecciona en vivo y aparece la ventana de adquisición de imágenes, seleccione en vivo nuevamente para pausar la recolección de fotones.
Para configurar las ventanas de recolección de datos de microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia o FLIM, haga clic derecho en la ventana de imagen en vivo y seleccione el complemento PicoQuant. Habilite mostrar curva de decaimiento, mostrar traza de tiempo y mostrar estadísticas FLIM. Para configurar la disposición del láser para el experimento celular, vaya a la configuración del experimento en la parte superior derecha de la página junto a los láseres.
Después de hacer clic en agregar junto al cuadro de tinte multicanal, agregue los tintes deseados. Seleccione el modo experto. Ajuste las asignaciones del detector para cada espectro de emisión.
Rute los espectros de excitación y emisión superpuestos a diferentes detectores. En el panel izquierdo, ajuste el orden de paso para minimizar la interferencia entre tintes con espectros de excitación y emisión superpuestos. Después de guardar y nombrar la nueva configuración del láser, seleccione la configuración guardada para el experimento.
Haga clic derecho en la ventana de adquisición en vivo. Elija controles de adquisición y luego seleccione XYZ general. Antes de cargar el plato de cultivo celular de imagen para FLIM, agregue la tinción nuclear celular viva y mezcle bien rotándola suavemente sobre el banco y déjela a un lado durante 30 segundos.
Coloque el plato de imagen sobre el escenario del microscopio. Empuje el plato hacia la esquina inferior izquierda del escenario del microscopio. Fije la muestra al escenario cuando use objetivos no de aire para evitar el desplazamiento XY.
Cambiar al canal 4'6-Diamidino-2-fenilindo o DAPI. Use el botón del controlador hasta que los núcleos celulares entren en enfoque. Si es necesario, ajuste la sensibilidad del botón de altura Z y, si las células no aparecen en la vista, ajuste las coordenadas XY.
Para habilitar el sistema de enfoque perfecto o enfoque automático PFS, en el lado derecho del panel AX, seleccione la lupa junto al botón PFS. Una vez que el microscopio haya normalizado automáticamente la altura Z, confirme que el botón PFS se ilumine y muestre que está en foco. Usando el detector AX, encuentre las células deseadas usando el canal DAPI.
Luego cambie al canal ATO 590 para identificar efectivamente las células cargadas con cuentas. Una vez que se identifica una célula y se centra haciendo doble clic, cambie a AX FLIM y FCS. Asegúrese de que esté seleccionado 512 por 512, ajuste el tamaño del marco haciendo clic y arrastrando las esquinas para que se ajuste a la célula.
Permita que el marco redimensionado se vuelva rojo. Haga clic derecho dentro del marco o seleccione en vivo hasta que el marco se vuelva verde para confirmar el ajuste. Después de ajustar el número de capturas al valor deseado, seleccione capturar.
Observe la nueva ventana de captura y el cuadro de progreso de captura en el lado derecho de la pantalla. Una vez que se abre el software de análisis FLIM, navegue hasta la ruta de archivo correcta. Observe las adquisiciones que se poblan automáticamente en la ventana del software de análisis.
Renomme las adquisiciones a medida que se recopilan. Cuando la captura se complete, cambie de nuevo al detector AX. Seleccione en vivo para buscar una nueva célula.
Ajuste el tamaño de la ventana AX FLIM y la espectroscopia de correlación de fluorescencia o FCS según sea necesario para células más grandes o más pequeñas. Después de adquirir nuevas células durante el período de imagen de tres horas, exporte el archivo sptw creado. Continúe con el procesamiento y análisis de datos FLIM para extraer mediciones de tiempo de vida de fluorescencia de las muestras recolectadas.
Las curvas de decaimiento representativas mostraron que la presencia de la etiqueta ARN A aumentó el tiempo de vida de la fluorescencia extraído in vitro, mientras que las muestras sin la etiqueta ARN A mostraron curvas de decaimiento desplazadas hacia la izquierda, lo que indica valores de tiempo de vida promedio más cortos. Los tiempos de vida de fluorescencia celular de las células cargadas con cuentas con 3xGly fueron significativamente más bajos que los cargados con 5xGly. Las curvas de decaimiento representativas mostraron que las células cargadas con 3xGly tenían curvas de decaimiento desplazadas hacia la izquierda en comparación con las células cargadas con 5xGly, lo que indica valores de tiempo de vida de fluorescencia promedio más bajos.
El núcleo de las células cargadas con sonda Riboglow mostró consistentemente tiempos de vida de fluorescencia más altos que el citosol de la misma célula. La ventana de adquisición de escala de color falsa, las curvas de decaimiento y los valores de amplitud promedio tau extraídos mostraron la misma tendencia de tiempo de vida de fluorescencia. Este protocolo permite a los investigadores determinar el tiempo de vida de fluorescencia de moléculas fluorescentes en diferentes contextos biológicos.
Los investigadores pueden realizar análisis de datos cuantitativos y evaluar variables de interés siguiendo este procedimiento, incluida la adición de ligandos de ARN. Los estudios futuros pueden aplicar Riboglow FLIM a modelos de enfermedades, expandir las capacidades de multiplexación y rastrear la dinámica del ARN en sistemas animales vivos.
Resumen
Este artículo presenta un protocolo detallado para Riboglow-FLIM, un sistema de biosensor de ARN codificado genéticamente que permite la visualización cuantitativa de moléculas de ARN en células mamíferas vivas mediante microscopía de vida media de fluorescencia (FLIM). El flujo de trabajo abarca la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y el análisis cuantitativo, facilitando el estudio de la dinámica y las interacciones del ARN en entornos controlados y en células vivas.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- biología del ARN
- microscopía de células vivas
- microscopía de fluorescencia
Antecedentes
- La mayor parte del genoma humano se transcribe en ARN no codificantes, que desempeñan diversas funciones reguladoras.
- La visualización cuantitativa de ARN en células vivas es esencial para comprender la dinámica del ARN, pero sigue siendo un desafío técnico.
- Riboglow es una plataforma de biosensores de ARN que utiliza un aptámero de ARN corto que se une a una sonda de molécula pequeña para generar una señal de tiempo de vida de fluorescencia.
- La microscopía de vida de fluorescencia (FLIM) permite la detección de estas señales, posibilitando la obtención de imágenes cuantitativas de ARN en entornos celulares complejos.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo integral para implementar Riboglow-FLIM in vitro y en células mamíferas vivas.
- Permitir la detección y análisis cuantitativos de ARN basados en la vida media de fluorescencia.
- Destacar consideraciones clave para la visualización reproducible y precisa de ARN mediante este método.
Métodos Utilizados
- Preparación de muestras de ARN o células vivas cargadas con perlas utilizando sondas Riboglow.
- Configuración y calibración del microscopio confocal de barrido láser y del sistema FLIM.
- Adquisición de datos de tiempo de vida de fluorescencia mediante configuraciones específicas de láser y detector.
- Análisis cuantitativo de conjuntos de datos FLIM, incluyendo la extracción de curvas de decaimiento y el análisis de regiones subcelulares.
Resultados principales
- In vitro, la presencia de la etiqueta de ARN A aumentó la vida media de fluorescencia, mientras que su ausencia produjo vidas medias más cortas.
- En células vivas, la carga de microesferas con diferentes variantes de la sonda Riboglow (por ejemplo, 3xGly frente a 5xGly) produjo firmas distintas de vida media de fluorescencia.
- El núcleo mostró consistentemente vidas medias de fluorescencia más altas que el citosol dentro de la misma célula.
- La imagen con colores falsos, las curvas de decaimiento y los valores de amplitud extraídos corroboraron todos las tendencias observadas en la vida media de fluorescencia.
Conclusiones
- Riboglow-FLIM permite una evaluación robusta y cuantitativa de la localización y dinámica del ARN en células vivas.
- El protocolo facilita una implementación reproducible y un análisis preciso de los datos en diversos contextos biológicos.
- Este enfoque puede extenderse a modelos de enfermedades, imágenes multiplexadas y estudios en animales vivos en investigaciones futuras.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La visualización cuantitativa de ARN en células mamíferas vivas representa un desafío crítico en la fase inicial del descubrimiento de fármacos, especialmente para comprender la dinámica del ARN no codificante y los mecanismos reguladores. El flujo de trabajo Riboglow-FLIM permite mediciones robustas y reproducibles de la localización e interacciones del ARN en entornos celulares complejos, lo que respalda la confianza predictiva en la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas. Esta capacidad fortalece la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la investigación preclínica al proporcionar datos cuantitativos y resueltos espacialmente sobre el ARN.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la localización y dinámica del ARN en células vivas para la validación funcional de objetivos.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante la cuantificación de las interacciones ARN-sonda y la distribución subcelular.
- Proporciona confianza predictiva para hipótesis terapéuticas dirigidas al ARN mediante mediciones cuantitativas de la vida media.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece ensayos de imagen cuantitativos validados para la detección de ARN en sistemas con células vivas y en sistemas in vitro.
- Facilita la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante salidas de tiempo de vida de fluorescencia y análisis de curvas de decaimiento.
- Permite la comparación confiable de variantes de sondas y condiciones experimentales para flujos de trabajo de cribado posteriores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea la visualización de ARN con modelos celulares relevantes para la enfermedad y el desarrollo potencial de biomarcadores.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el seguimiento cuantitativo de ARN en sistemas complejos.
- Ofrece una plataforma para imágenes multiplexadas y una futura expansión hacia modelos de enfermedad y estudios en animales vivos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El protocolo Riboglow-FLIM se integra en la continuidad de descubrimiento a preclínico al permitir la obtención de imágenes cuantitativas de ARN, desde la validación in vitro hasta el análisis en células vivas y modelos tridimensionales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar la localización del ARN y la unión de sondas.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles de ensayos para comparar variantes de sondas y condiciones experimentales.
- Análisis: Ofrece mediciones de la vida media de la fluorescencia, curvas de decaimiento y valores de amplitud para un análisis de datos robusto.
- Investigación Traductacional: Facilita la alineación con modelos de enfermedades y apoya el desarrollo de estrategias de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma de imagen estandarizada y escalable, adaptable a diversos sistemas biológicos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación dirigida al ARN.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad de los flujos de trabajo de imágenes de ARN.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de continuar o descartar proyectos y la eficiencia del capital al proporcionar datos cuantitativos y reproducibles.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de programas dirigidos al ARN.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía confocal, instrumentación de FLIM y análisis cuantitativo de imágenes.
- Exige acceso a sistemas de FLIM calibrados y software compatible para la adquisición de imágenes.
- Necesita un control riguroso de los parámetros experimentales y de adquisición para garantizar la reproducibilidad.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes tipos celulares, variantes del sonda o escenarios de imágenes multiplexadas.
- Depende de una selección cuidadosa de la región de interés y de un procesamiento adecuado de los datos para obtener resultados cuantitativos precisos.
