Ensayo de protección con amikacina para cuantificación y visualización de la invasión celular de Escherichia coli

Nos centramos en caracterizar cómo la invasora adhesiva de E. coli invade las células epiteliales intestinales e identificar los factores bacterianos que contribuyen a este proceso. Los aislados resistentes a la gentamicina limitan los ensayos tradicionales de invasión. Este protocolo basado en amikacina permite la cuantificación precisa de bacterias intracelulares.

Para empezar, reúne todos los reactivos y medios necesarios para el ensayo de invasión. A continuación, recupera el stock congelado de glicerol de la cepa invasiva de Escharicia colli, o AIEC, del congelador a 80 grados Celsius. Utilizando una punta de palo o pipeta de madera estéril, raspa suavemente las bacterias del tallo y ponlas en una placa de barrena Luria-Bertani, o LB, para obtener colonias individuales.

Incuba la placa a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, usando una barra de madera o una punta de pipeta, elige una sola colonia de la placa del sinfín. Inocúla la colonia en 3 mililitros de caldo LB e incuba el cultivo a 37 grados Celsius a 200 revoluciones por minuto durante la noche.

Luego realiza una dilución de 1 a 10 del cultivo nocturno en 1 mililitro de LB de caldo. Mide la densidad óptica a 600 nanómetros del cultivo diluido usando un espectrofotómetro. Transfiere 100 microlitros del cultivo nocturno a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifuga a 6.000 G durante 10 minutos a 4 grados Celsius.

Aspirar el sobrenadante cuidadosamente sin alterar el pellet celular y volver a suspender el pellet en 1 mililitro de suero y medios libres de antimicóticos antimicóticos. Calcula el volumen requerido de suspensión bacteriana para lograr una multiplicidad de infección o MOI de 10 usando la fórmula proporcionada. Para preparar el medio de infección, transfiere el volumen calculado de la suspensión bacteriana a un tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y completar el volumen a 1 mililitro con suero y medios libres de antibióticos antimicóticos.

Mezcla suavemente pipeteando arriba y abajo varias veces. Prepara una placa de 96 pozos para determinar las unidades formadoras de colonias por mililitro del cultivo bacteriano diluido durante la noche realizando diluciones en serie diez veces más en PBS estéril 1X. Transfiere 200 microlitros del cultivo diluido durante la noche al primer pozo de la placa.

Pipetear 20 microlitros del cultivo en la siguiente fila que contiene 180 microlitros de PBS 1X. Mezcla pipeteando arriba y abajo 10 veces y repite el proceso de dilución hasta llegar a 10 a la potencia de 6 usando una punta nueva de pipeta cada vez. Ahora se cubren 10 microlitros de diluciones puntuales en triplicado desde las 10 a la potencia de 2 a 10 hasta la potencia de 6 diluciones sobre placas sinfín LB.

Permite que las manchas se absorban en el sinfín cerca de una llama. Incuba las placas durante la noche a 27 a 30 grados Celsius para evitar el sobrecrecimiento de la colonia y obtener colonias individuales claras. Retirar las monocapas epiteliales confluentes Caco-2 sanas cultivadas en una placa de cultivo de 24 pozos recubierta de colágeno de la incubadora y aspirar el medio completo de cada pozo.

Pipete un mililitro de suero y medios libres de antibióticos en cada pozo. Aspira el medio para eliminar restos de material y repite el lavado una vez más, para un total de dos lavados. Ahora añade 1 mililitro del medio de infección previamente preparado que contiene AIEC en cada pozo de la placa de 24 pozos que contiene las células Caco-2.

Centrifugar la placa de 24 pozos a 500 G durante 15 minutos a temperatura ambiente para sincronizar el contacto bacteriano con la monocapa epitelial e incubar la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante tres horas para permitir la invasión bacteriana. Prepara medios que contengan antibióticos añadiendo 240 microgramos por mililitro de amikacina a suero precalentado y medios libres de antibióticos antimicóticos. Tras el periodo de infección, aspira el medio de las monocapas de células Caco-2 y lava cada pozo con 1 mililitro de suero y medio libre de antimicóticos antibióticos.

Aspira el substrato y repite el lavado una vez más, para un total de dos lavados. Luego se introduce un mililitro de 240 microgramos por mililitro de medios que contienen amikacina en cada pozo. En paralelo, se trata otro conjunto de células con 100 microgramos por mililitro de gentamicina para comparar e incubar las células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 1 hora para eliminar bacterias extracelulares.

Tras la incubación, aspira el medio de cada pozo. Añade 1 mililitro de PBS para eliminar las bacterias adherentes. Aspira el PBS y repite el lavado una vez más, para un total de dos lavados.

Ahora añade 200 microlitros de 1% de Triton X100 diluido en PBS en cada pozo e incuba en un agitador orbital a 90 revoluciones por minuto durante 10 minutos para lisar las células epiteliales. Pipetear hacia arriba y abajo aproximadamente 30 veces por pozo para desprender las células de la placa. A continuación, realiza diluciones en serie diez veces más de los lisados celulares en una placa de 96 pozos usando PBS.

Placa 10 microlitros de diluciones puntuales en triplicado desde las no diluidas hasta 10 a la potencia de 3 diluciones sobre placas sinfín LB. Después de que las manchas se sequen, incuba las placas durante la noche a 27 a 30 grados Celsius para obtener colonias individuales claras. Tras la incubación, retirar las placas y contar las colonias bien aisladas de las diluciones puntuales apropiadas que contengan más de siete colonias por mancha a lo largo de los triplicados.

Finalmente, calcular el inóculo y las unidades formadoras de colonias recuperadas por mililitro y el porcentaje de invasión utilizando las ecuaciones. El tratamiento con gentamicina o amikacina tras la infección de monocapas de células Caco-2 con la cepa invasiva AIEC NRG857c, o con la cepa no invasiva Escherichia coli DH5 alfa control, resultó en perfiles de invasión similares. Estos hallazgos indicaron que la amikacina era tan eficaz como la gentamicina para eliminar bacterias extracelulares y reflejaba con precisión la carga bacteriana intracelular.

El tratamiento de aislados clínicos de Escherichia coli resistentes a gentamicina obtenidos de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal con gentamicina resultó en valores de recuperación bacteriana muy variables, que oscilaban entre el 21 y el 2.788%. En contraste, el tratamiento con amikacina redujo drásticamente la recuperación bacteriana en todos los aislamientos, demostrando su eficacia y permitiendo mediciones de invasión más fiables. Este protocolo permite la cuantificación precisa de bacterias intracelulares y la evaluación de la invasión bacteriana en células epiteliales. Se pueden utilizar métodos adicionales como la microscopía de inmunofluorescencia para validar aún más la invasión bacteriana y validar la localización intracelular.

Estudios futuros pueden identificar nuevos factores de virulencia e investigar las vías del huésped que se dirigen durante la infección invasiva adherente por E. coli.