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<table><tbody><tr><td>1.5 mL microtubes Axygen</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate Falcon polystyrene microplate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético, 60%&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamide 30%&nbsp; y solución de bis-acrilamida, 29:1</td><td>Biorad</td><td>1610157</td><td></td></tr><tr><td>Aluminio para plegar</td><td>Reynolds&nbsp;</td><td>U07211R0</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Merck</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico binocular</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino (BSA)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>&nbsp;A9418</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio DelltaVision</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada H2O</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro desechables con filtros PES de poro de 0,45 &mu;m</td><td>Thermo Fisher Scientific/Nalgene</td><td>09-740-63B</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas FST Dumont SS</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>cabra (IgG H+L) altamente adsorbida en cruz anti-rata etiquetada por AlexaFluor647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>cabra (IgG H+L) altamente adsorbida en cruz anti-conejo etiquetada por AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>cabra (IgG H+L) altamente adsorbida en cruz anti-conejo etiquetada por AlexaFluor488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11073</td><td></td></tr><tr><td>Guantes</td><td>Merck</td><td>Z412392</td><td></td></tr><tr><td>Cámaras de cultivo / invernadero / o campo</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Merck</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva 3M</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-047-259</td><td></td></tr><tr><td>Semillas de maíz</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio 22 x 22 mm-1,5 de vidrio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio 22 x 22 mm-H&nbsp;</td><td>Deckgläser, Zeiss</td><td>474030-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Diapositivas de microscopio de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Caja para diapositivas de microscopio</td><td>Fisher Scientific,</td><td>03-448-9</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas P20, P200, P1000</td><td>Merck</td><td>CLS4069</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Toallas de papel</td><td>Merck</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td>P7668</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído solución 16%&nbsp;</td><td>Grado de Microscopía Electrónica</td><td>&nbsp;15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck</td><td>P4474</td><td></td></tr><tr><td>Caja de plástico con tapa</td><td>Tupperware</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos primarios (anti-ZmAFD1 de rata, anti-ZmASY1 de conejo, anti-ZmZYP1 de cobayo)</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong Antifading</td><td>Molecular Probes</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (D x H: 35 mm x 10 mm</td><td>Corning</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri tamaño regular</td><td>Merck</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Merck</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (0.5-10 uL) estériles&nbsp;</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT300</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (200 uL) estériles</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT200Y&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (1000 uL) estériles</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT1000BRS</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar de un solo filo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de plataforma oscilante</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Espermina</td><td>Merck</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina&nbsp;</td><td>Merck</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Merck</td><td>S8143</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida ultra pura</td><td>Invitrogen</td><td>15512023</td><td></td></tr><tr><td>Vacío</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inmunolocalización tridimensional en meiocitos de maíz

Three-Dimensional Immunolocalization In Maize Meiocytes

Inmunolocalización tridimensional en meiocitos de maíz

During meiotic prophase I, the physical configuration of chromosomes varies widely across developmental stages, fortunately these stage-specific ...

Nuestra investigación se centra en desarrollar un enfoque tridimensional para estudiar meiocitos masculinos de maíz y visualizar proteínas meióticas en células individuales. Además del maíz, este protocolo puede aplicarse para estudiar meiocitos en arroz, centeno, cebada y trigo. Para comenzar, obtenga plantas de maíz en la etapa V13 con inflorescencias aún en crecimiento dentro del tallo.Durante la semana de la fijación de anteras en meiosis, presione suavemente el tallo agrandado en la protuberancia mientras lleva guantes para verificar si es lo suficientemente blando como para cortarlo. Después de preparar los tampones necesarios, prepare una cámara húmeda colocando de cinco a diez toallas de papel humedecidas dentro de una caja de plástico. Retire el exceso de agua de la cámara.Con una cuchilla de afeitar, corte el tallo a nivel de la inflorescencia para exponer las ramas de la panícula y las ramas laterales. Después de diseccionar y recolectar las ramas laterales, envuélvalas en toallas de cámara húmeda manteniendo la cámara a temperatura ambiente. Utilizando un microscopio estereoscópico, recolecte anteras frescas de las flores en una placa de Petri de 35 milímetros que contenga dos mililitros de tampón A 1X o BA. Identifique las fases meióticas según el tamaño y el color.Después de transferir las anteras a una nueva placa de Petri de 35 milímetros, agregue tres mililitros de solución fijadora a las anteras. Selle la placa de Petri con parafilm para evitar la evaporación del formaldehído. Coloque la placa de Petri de 35 milímetros sobre la placa de Petri más grande colocada en un agitador rotatorio, ajustado a 40-60 RPM a temperatura ambiente durante 45 minutos.Lave los anteras con tres mililitros de XBA 1X. Después de transferir los anteras a una pequeña placa de Petri, selle la placa y colóquela en un agitador rotatorio a temperatura ambiente durante 45 minutos con la velocidad ajustada entre 40 y 60 RPM. Utilizando pinzas limpias, transfiera los anteras a una pequeña placa de Petri de 35 milímetros que contenga tres mililitros de XBA 1X.Una vez que la placa de Petri esté bien sellada con parafilm, coloque la placa de Petri pequeña dentro de una placa de Petri más grande. Después de cubrirla con papel de aluminio, almacene la muestra a cuatro grados Celsius hasta su uso. En el día uno, prepare dos mililitros de solución de acrilamida mezclando volúmenes iguales de acrilamida y dos XBA.Degase la solución de acrilamida al vacío durante cinco a diez minutos antes de añadir sulfito sódico y persulfato amónico. Aliquote 100 microlitros de una mezcla uno a uno de acrilamida y dos XBA en tubos de 1,5 mililitros según el número de portaobjetos preparados. Coloque trozos de parafina de dos centímetros por dos centímetros sobre una placa de Petri y colóquelos bajo un estereoscopio de disección.Después de recortar la punta de la pipeta usando tijeras, pipetee 50 microlitros de solución BA con anteras sobre el parafilm. Pipetee 25 microlitros de solución BA sobre otra zona del parafilm. Después de sostener las anteras con pinzas, usando un escalpelo, corte sus puntas.Una vez que los meiocitos sean expulsados, utilice una pipeta para transferirlos a la gota de BA de 25 microlitros y mezcle suavemente. Pipete 10 microlitros de la mezcla de meiocitos sobre un portaobjetos separado. Añada rápidamente cinco microlitros de sulfito de sodio y cinco microlitros de peroxodisulfato de amonio en un tubo de 1,5 mililitros que contenga acrilamida y dos XBA.Pipetee cinco microlitros de esta mezcla sobre el cubreobjetos y mézclelo con los meiocitos. Coloque encima un cubreobjetos recubierto con poli-lisina formando un ángulo de 45 grados. Después de permitir de 30 a 50 minutos para la polimerización completa a temperatura ambiente, separe cuidadosamente los cubreobjetos utilizando una cuchilla de afeitar.Luego, colóquelos con el lado del pad hacia arriba en una placa de Petri. Enjuague el cubreobjetos con un mililitro de PBS 1X suplementado con un milimolar de ácido etilendiaminotetraacético, o EDTA, y 1% de Triton a temperatura ambiente durante dos horas. Prepare y combine anticuerpos primarios de diferentes especies huésped para garantizar señales distintas durante la detección.Añada 50 microlitros del anticuerpo primario diluido en el centro del cubreobjetos que contiene la almohadilla. Luego, coloque la placa de Petri en una cámara húmeda durante la noche. En el día dos, prepare 500 mililitros de tampón de lavado que contenga un XPBS, 0,1 % de Tween 20 y un milimolar de EDTA.Utilizando una pipeta, retire la solución de la noche anterior. Lave el cubreobjetos dos veces con un mililitro de tampón de lavado. Después de eliminar el tampón, agregue nuevamente un mililitro de tampón de lavado e incube durante una hora a temperatura ambiente.Repita este paso de lavado siete veces más. Después del lavado final, cubra el recipiente y déjelo durante la noche en una cámara húmeda. Prepare los anticuerpos secundarios diluyéndolos en una proporción de uno a 50 en tampón de bloqueo.Después de eliminar la solución de lavado, agregue 50 microlitros del anticuerpo secundario diluido al centro de cada almohadilla. Luego, coloque la placa de Petri en una cámara húmeda durante dos horas a temperatura ambiente. Después de retirar la solución del pocillo, lave cuatro veces con un mililitro de tampón de lavado durante una hora cada vez a temperatura ambiente.Lave el pocillo con un mililitro de PBS durante 10 minutos y repita este proceso dos veces más. Añada 500 microlitros de DAPI, preparado a una concentración final de un microgramo por mililitro, al pocillo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el prolongado dorado de cuatro grados Celsius, déjelo descongelar hasta alcanzar la temperatura ambiente.Lave las laminillas con un mililitro de PBS durante 30 minutos y repita dos veces. Después de eliminar la última solución de lavado, agregue dos gotas de agente antifade prolongado en el centro del portaobjetos. Una vez que se levante la cubreobjetos del pocillo, colóquela sobre las laminillas etiquetadas.Utilizando un vacío, retire el exceso de glicerol de los bordes del cubreobjetos y selle con dos capas de esmalte de uñas. Observe las preparaciones al microscopio utilizando longitudes de onda de excitación y filtros adecuados para capturar imágenes. La tinción con DAPI mostró un núcleo bien definido y tinción de la cromatina, junto con una tinción citoplasmática nativa más tenue del ADN de plastidios y mitocondrias.Ausencia de ausencia de la primera división uno o AFD1, asináptica uno o ASY1, y Zipper1 o ZYP1 localizados en los cromosomas y en el citoplasma durante la preleptonema. En etapas posteriores, la señal se concentró en el cromosoma, mientras que una cantidad considerable de ZYP1 permaneció en el citoplasma antes de la sinapsis completa. La cohesina meiótica AFD1 formó una estructura lineal solo después de la zigonema.Concomitantemente con la formación de filamentos lineales del complejo sinaptonémico. La señal de ASY1 se volvió comparativamente tenue después de que ZYP1 y AFD1 se incorporaron a estructuras lineales. Este protocolo permite a los investigadores estudiar la co-localización y dinámica de proteínas, la localización subcelular nativa, la arquitectura cromosómica tridimensional, la progresión meiótica y la determinación de etapas.El principal desafío en este protocolo consiste en seleccionar cuidadosamente combinaciones compatibles de anticuerpos primarios y secundarios. Los estudios pueden basarse en este trabajo comparando la meiosis masculina y femenina para investigar el mecanismo molecular subyacente a la atelcasmia.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Hibridación in situ para la localización precisa de las transcripciones de las plantas

Se presenta una forma de obtener nuevos conocimientos sobre la complejidad de la respuesta inflamatoria cerebral. Describimos protocolos basados en inmunofluorescencia seguidos de análisis confocal tridimensional para investigar el patrón de coexpresión de marcadores fenotípicos de microglía/macrófagos en un modelo murino de isquemia focal.

Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

El protocolo de inmunofluorescencia indirecta descrito en este artículo permite la detección y la localización de las proteínas en la glándula mamaria del ratón. Un método completo se da para preparar muestras de glándula mamaria, para llevar a cabo la inmunohistoquímica, a la imagen las secciones de tejido mediante microscopía de fluorescencia, y para reconstruir imágenes.

Inmunofluorescencia indirecta en secciones congeladas de ratón Glándula Mamaria

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Este protocolo presenta cómo viven la imagen y analizar los meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas mediante microscopía confocal de barrido láser.

Proyección de imagen confocal vivo de meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas

Presentamos aquí un protocolo mejorado para la preparación de montaje completo y la inmunotensión de los testículos de Drosophila, adecuado para la microscopía confocal y también permitiendo el etiquetado reproducible y confiable. Ilustramos este protocolo por la representación y la cuantificación 3D de los experimentos del colocalization en los spermatocytes grandes S4-S5.

Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes

Se presenta un protocolo de inyección (agroinyección) a base de Agrobacterium para la inoculación del virus del mosaico de la cola de zorro y los clones del virus del mosaico de la caña de azúcar en las plántulas de maíz. La inoculación de esta manera conduce a la infección viral, el silenciamiento génico inducido por virus de los genes marcadores y la sobreexpresión viral de GFP.

Agroinoculación directa de plántulas de maíz por inyección con clones infecciosos recombinantes del virus del mosaico de la cola de zorro y virus del mosaico de la caña de azúcar

Los primordios de hojas de maíz están profundamente enfundados y enrollados, lo que los hace difíciles de estudiar. Aquí, presentamos métodos para preparar secciones transversales y montajes enteros desenrollados de primordios de hojas de maíz para imágenes fluorescentes y confocales.

Métodos mejorados para preparar secciones transversales y montajes enteros desenrollados de primordios de hojas de maíz para imágenes de fluorescencia y confocales

En este manuscrito se detalla un protocolo de inoculación optimizado que utiliza vainas de hojas de maíz desprendidas para estudios citológicos, fisiológicos y moleculares reproducibles de las interacciones del maíz con los patógenos fúngicos de las plantas. Las vainas de las hojas facilitan la observación en tiempo real de las interacciones celulares entre la planta viva y el hongo en tejidos no fijados.

Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz

El movimiento cromosómico durante la profase meiótica es un fenómeno poco conocido que es fundamental para la formación de esporas. Este protocolo describe un método para adquirir, analizar y cuantificar los movimientos del centrómero durante la profase meiótica en los meiocitos masculinos de Arabidopsis thaliana .

Caracterización por imágenes en vivo de los movimientos del centrómero durante la profase meiótica masculina en Arabidopsis thaliana

255 vistas.  National Autonomous University of Mexico (UNAM). Nuestra investigación se centra en desarrollar un enfoque 3D para estudiar los meiocitos masculinos del maíz y visualizar las proteínas meóticas en células individuales. Además del maíz, este protocolo se puede aplicar para estudiar meiocitos en arroz, centeno, cebada, trigo. Para comenzar, obtenga plantas de maíz en la etapa V13 con inflorescencias aún creciendo dentro del tallo.Durante la semana de fijación de anteras mióticas, presione suavemente el tallo agrandado en el ...

Inmunolocalización tridimensional en meiocitos de maíz

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